Coronavirus Test: Real time RT-PCR - Animation video

Summary

このスクリプトは、COVID-19という感染症の検査プロセスについて詳しく説明しています。まず、症状が発症すると、鼻咽頭スワブか口咽頭スワブを使用してサンプルを採取します。次に、RT-PCRという陰性RNAを検出する手法を使って、ウイルスのRNAを特定のDNAフラグメントに変換します。その後、RNAを抽出し、PCRアンプリファイケーションの反応混合物を準備します。その過程で、ターゲット遺伝子を増幅し、リアルタイムRT-PCRを使用してウイルスの存在を検出します。この手法は、非常に少量のサンプルでも分析が可能であり、PCRの進行状況をリアルタイムで監視できます。

Takeaways

• 🦠 COVID-19は、重度急性呼吸症候群コロナウイルス2によって引き起こされる感染症です。
• 🤒 感染した場合、最も一般的な症状は発熱、咳、呼吸困難です。
• 🧪 検査を始めるには、鼻咽頭スワブまたは口咽頭スワブを使用してサンプルを収集します。
• 📍 鼻咽頭スワブでは、スワブが鼻孔に挿入され、ナゾファリンクスに向かって前へ移動してウイルスを含む分泌液を収集します。
• 🧬 PCR（聚合酶連鎖反応）は、分子生物学で特定のDNAフラグメントを大量に複製するために広く使用される標準的なコロナウイルス検査方法です。
• 🧬 コロナウイルスには非常に長い単一鎖RNAゲノムがあり、RT-PCRを使用してこれらのウイルスを検出するために、RNA分子を補完DNAシーケンスに変換する必要があります。
• 🧪 RNAを抽出するには、商用キットを使用して、サンプルをマイクロセントリファッジチューブに加え、溶離バッファと混ぜます。
• 🧲 スピンコラムを使用したRNAの純化では、RNA分子は最適な塩濃度とpH条件下でシリカゲル膜に結合し、他の汚染物は留まりません。
• 🧪 PCRアンプリフィケーションのための反応混合物の準備では、バッファ、逆転スクリプト酶、塩基、前向きプライマー、逆向きプライマー、TaqManプローブ、DNAポリメラーゼが含まれるマスターミックスが使用されます。
• 🔬 リアルタイムRT-PCRは、RdRp遺伝子、E遺伝子、N遺伝子のターゲットシーケンスの増幅によって新型コロナウイルス2019を検出するために使用されます。
• 🔬 タクママンプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの5'末端に結合された蛍光物とクエンチャーで構成されており、プローブがDNAポリメラーゼによって切断されると、蛍光物はクエンチャーから分離され、蛍光を発します。
• 📈 PCRの各サイクルで、TaqManプローブの荧光が増加し、その強度は増幅されたアムプリコンの量に比例します。これにより、非常に少量のサンプルを分析することができます。

Q & A

COVID-19はどのような疾患を引き起こす感染症ですか？

COVID-19は、重度急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によって引き起こされる感染症です。

COVID-19に感染した場合、最も一般的な症状は何ですか？

感染した場合、最も一般的な症状は発熱、咳嗽、および呼吸困難です。

COVID-19の検査で使用される2つの主要な検体収集方法は何ですか？

COVID-19の検査で使用される2つの主要な検体収集方法は、鼻腔後部スワブと口腔後部スワブです。

RT-PCRとは何ですか？

RT-PCRは、RNA分子を補完的なDNAシーケンスに変換し、その後標準的なPCR手順で増幅する手法であり、広く分子生物学で使用されています。

PCR増幅の前に、検体のRNAをどのように抽出するのですか？

RNAを抽出するために、商业的なキットを使用して、検体をマイクロセントリフュージュチューブに加え、リンシスバッファと混ぜ合わせます。その後、pulse-vortexingを行い、室温で保温してウイルスをリンシスします。その後、スピンコロンで純化手順を行い、RNAを結晶シリカに結合させ、不純物を除去します。

PCR反応混合物の準備で使用されるマスターミックスとは何ですか？

マスターミックスは、バッファ、逆転スクリプト酶、塩基、前向きプライマー、逆向きプライマー、TaqManプローブ、およびDNAポリメラーゼを含む、PCR増幅用の前混合された濃縮液です。

リアルタイムRT-PCRとは何ですか？

リアルタイムRT-PCRは、RdRp遺伝子、E遺伝子、およびN遺伝子内の標的シーケンスの増幅を使用して、新しいコロナウイルス2019を検出するための手法です。

RT-PCRの最初のステップである逆転録とは何ですか？

逆転録は、PCRの逆転スクリプト用プライマーを使って、ウイルスRNA遺伝子の補完部分に結合し、そのプライマーの3'末端にDNA核苷酸を加えることで、ウイルスRNAに補完するDNAを合成するプロセスです。

PCRサイクルのデンアトレーションステップは何を行いますか？

デンアトレーションステップは、反応室内を95℃に加熱し、二重結合DNAテンプレートを解離することで、DNAポリメラーゼを活性化し、同時に逆転スクリプト酶を失活させます。

TaqManプローブとは何ですか？また、どのように機能しますか？

TaqManプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの5'末端に共价的に結合されたフオロフォアを持つもので、フオロフォアがサイクルの光源で興奮すると蛍光を放出します。また、3'末端にはクエンチャーが存在し、フオロフォアの蛍光を検出できないようにします。DNAポリメラーゼがプローブに到達すると、その内蔵の5'クレアセアゼ活性でプローブを切断し、染料をクエンチャーから分離させます。これにより、PCRの各サイクルで、より多くの染料分子が放出され、増幅子合成量に比例する蛍光強度の増加が得られます。

リアルタイムPCRで使用される蛍光信号の測定にはどのような部品が必要ですか？

リアルタイムPCRで蛍光信号を測定するためには、タングステン-ハロゲンランプ、興奮フィルター、鏡、レンズ、放出フィルター、およびチャージカップルドevice (CCD) カメラが必要です。

Outlines

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🧫 COVID-19の検査方法とRT-PCRの概要

COVID-19は、重度急性呼吸症候群コロナウイルス2によって引き起こされる感染症です。感染者は発熱、咳、呼吸困難などの症状を示します。検査では、鼻咽頭スワブまたは口咽頭スワブを使用してサンプルを採取します。RNAを検出するために、RT-PCRというPCRの手法が用いられます。これは、RNAをcDNAに変換し、その後標準的なPCR手順で増幅します。RNAの抽出には、商用キットを使用し、溶離バッファとスピンコロンで純化します。次に、PCRアンプリファイケーション用の反応混合物を準備し、RT-PCRマシンで検出を行います。

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🔬 RT-PCRの詳細プロセスと検出方法

RT-PCRは、RNAを第一鎖cDNAに合成し、その後DNAポリメラーゼで増幅します。PCRは、解離、アニーリング、および拡張という3つのステップから成る熱サイクルを繰り返します。TaqManプローブを使用して、新たなDNA鎖の合成と同時に、フオロホルとクエンチャーを分離し、荧光を測定します。これにより、PCRサイクルごとの増幅量を監視し、非常に少量のサンプルから特定のシーケンスの量を推定できます。リアルタイムPCRは、反応の進行状況をリアルタイムで監視できる手法です。

Keywords

💡COVID-19

COVID-19は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によって引き起こされる感染症です。このキーワードはビデオの中心テーマであり、感染の原因や検査方法など、ビデオ全体のメッセージに関連しています。

💡症状

症状とは、疾病や障害を示す身体的または精神的変化です。ビデオでは、感染者が発症する一般的な症状として、熱、咳、呼吸困難が説明されています。これらはCOVID-19の診断において重要な指標となります。

💡PCR（聚合酶連鎖反応）

PCRは、分子生物学で使用される手法で、特定のDNAフラグメントを短時間で何百万から何十億個まで増殖させることができます。ビデオでは、PCRがコロナウイルス検出に使われることに焦点が当てられており、その重要性が強調されています。

💡RT-PCR（リバーストランスクリプト酶連鎖反応）

RT-PCRは、RNAをDNAに変換し、その後PCRで増殖させる手法です。コロナウイルスはRNAをゲノムとして持つため、RT-PCRはこれらのウイルスを検出するのに適した方法です。ビデオでは、RT-PCRがウイルスRNAの検出に用いられるプロセスを詳細に説明しています。

💡RNA抽出

RNA抽出は、RNAを他の細胞成分から分離するプロセスです。ビデオでは、RNA抽出キットを使用した手順が説明されており、これはPCRアンプライフィケーションの前提条件となります。RNA抽出は、ウイルスのRNAを精製し、PCRでの分析に備えるために必要です。

💡スピンカラム

スピンカラムは、RNA抽出プロセスで使用される固相抽出方法です。ビデオでは、スピンカラムを使用して、RNA分子を結合させ、他の蛋白质や汚染物を排除するプロセスが説明されています。これは、RNAを純粋に抽出するために重要なステップです。

💡反応混合物

反応混合物は、PCRアンプライフィケーションに必要なすべての成分を含んだ事前混合された濃縮液です。ビデオでは、バッファ、リバーストランスクリプト酶、核苷酸、前進プライマー、逆プライマー、TaqManプローブ、そしてDNAポリメラーゼが含まれていることが説明されています。これは、PCRプロセスを開始するために必要です。

💡TaqManプローブ

TaqManプローブは、PCRプロセスで使用されるフロレスセントマーカーで、DNAポリメラーゼが新しいDNA鎖を合成するときに、プローブを切断します。ビデオでは、TaqManプローブがどのように使用され、PCRサイクルごとの荧光強度増加を通じてウイルスRNAの量を推定するのに役立つのかが説明されています。

💡熱循環

熱循環は、PCRプロセスで繰り返し行われる熱処理のサイクルです。ビデオでは、デンアトレーション、アニーリング、およびエクステンションという3つのステップで構成されており、これらが新しいDNA鎖を合成するプロセスを制御していることが説明されています。

💡リアルタイムPCR

リアルタイムPCRは、PCR反応の進行をリアルタイムで監視できる手法です。ビデオでは、リアルタイムRT-PCRが新しいコロナウイルス2019の検出に使用されており、その感度と正確性が強調されています。この手法を使用することで、非常に少量のサンプルからウイルスRNAを検出することができます。

💡チャージカップルドevice（CCD）カメラ

CCDカメラは、リアルタイムPCRで使用される装置で、受光部から放出される荧光を検出します。ビデオでは、CCDカメラがフィルタ通過された光を集光レンズに集中させ、各ウェルの中心にフォーカスし、ウェルから放出される蛍光を検出するプロセスが説明されています。これにより、PCR反応の進行をリアルタイムで監視することが可能です。

Highlights

COVID-19 is caused by the SARS-CoV-2 virus, with symptoms including fever, cough, and shortness of breath

Nasopharyngeal and oropharyngeal swabs are used to collect samples for testing

The standard method for coronavirus testing is RT-PCR, which makes millions of copies of a DNA fragment

Coronaviruses have a long single-stranded RNA genome that must be converted to DNA for PCR detection

RNA purification kits are used for fast and effective isolation of viral RNA

The lysis buffer contains phenol and guanidine isothiocyanate to denature the virus and isolate RNA

RNA binds to the silica gel membrane in the spin column, while proteins and contaminants are washed away

The purified RNA is free of protein, inhibitors and other contaminants, ready for PCR

The master mix for PCR contains buffer, enzymes, nucleotides, primers, probe and DNA polymerase

Real-time RT-PCR detects the new coronavirus by amplifying target sequences in the Rdrp, E and N genes

Reverse transcription synthesizes DNA complementary to the viral RNA using the PCR reverse primer

PCR consists of thermal cycles with denaturation, annealing and extension steps

The TaqMan probe emits fluorescence when cleaved by DNA polymerase during the extension step

The increase in fluorescence intensity with each PCR cycle allows quantifying the target sequence

PCR can analyze extremely small sample amounts as the target DNA is amplified exponentially

Real-time PCR measures the fluorescence signal using a tungsten-halogen lamp, filters, lens and a CCD camera

The CCD camera converts the captured light into digital data, enabling real-time monitoring of the PCR reaction

Transcripts

COVID-19 is an infectious disease caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2

When a person is infected, the most common symptoms include fever, cough, and shortness of breath

To start a test

The samples can be collected by a nasopharyngeal swab or an oropharyngeal swab. For Nasopharyngeal specimen

the swab is inserted in the nostril and gently moved forward into the nasopharynx

then it is rotated for a specified period time to collect secretions that contain the virus

Once the swabbing is applied, the swab is placed immediately into sterile tube containing a viral transport medium

The standard method of coronavirus testing is polymerase chain reaction, PCR

Which is a method that used widely in molecular biology to make millions to billions of copies of a specific DNA fragment rapidly

Coronaviruses contain an extraordinarily long single-stranded RNA genome

To detect these viruses with PCR, RNA molecules must be converted into their complementary DNA sequences by reverse transcriptase

Then the newly synthesized DNA can be amplified by standard PCR procedures

This approach is universally known as RT-PCR

To perform this method, basically viral RNA should be extracted

Several RNA purification kits are available for convenient, fast and effective isolation

To extract the viral RNA by using commercial kit

the sample is first added into a microcentrifuge tube. Then it's mixed with a lysis buffer

This buffer is highly denaturing and is usually consists of phenol, and guanidine isothiocyanate

Also, RNase inhibitors are usually present in the lysis buffer to ensure isolation of intact viral RNA

Once the lysis buffer is added, the tube is mixed by pulse-vortexing, and incubated at room temperature

Then the virus is lysed under the highly denaturing conditions provided by the lysis buffer

Once the sample is lysed, a purification procedure is carried out by using a Spin column

the sample is loaded onto the spin column

then a centrifugation is performed

This procedure is a solid phase extraction method, in which the stationary phase consists of a silica matrix

Under optimal salt and pH conditions, RNA molecules are bind to the silica gel membrane, and at the same time

protein and other contaminants are not retained

After centrifugation, the spin column is placed into a clean collection tube, and the filtrate is discarded. Then a wash buffer is added

The column is put in a centrifuge again, forcing the wash buffer through the membrane.This removes any remaining impurities from the membrane

leaving only the RNA bound to the silica gel

Once the sample is washed, the column is placed in a clean microcentrifuge tube, and an elution buffer is added

Then a centrifugation is carried out, forcing the elution buffer through the membrane

The elution buffer removes the viral RNA from the spin column

And a purified RNA, which is free of protein, inhibitors, and other contaminants is obtained

After the extraction of the viral RNA, the next step is the preparation of the reaction mixture for PCR amplification

In this step, a master mix is used which is a premixed concentrated solution, that consists of buffer, Reverse Transcriptase enzyme

Nucleotides, Forward Primer, Reverse Primer, TaqMan probe, and DNA polymerase

Finally, to complete this reaction mixture, the RNA template is added

The tube is Mixed by pulse-vortexing

then the reaction mixture is loaded into a PCR plate, which generally contain 96 wells

Allowing the analysis of several samples at the same time

Next, the plate is placed in a PCR machine, which is essentially a thermal cycler

Real-time RT-PCR is used for the detection of the new coronavirus 2019

by the amplification of target sequences in the Rdrp gene, the E gene and the N gene

The choice of the target gene depends on the primers and the probe sequences

The first step in RT-PCR is reverse transcription

The first-strand complementary DNA synthesis, is primed with the PCR reverse primer

which hybridizes to a complementary part of the virus RNA genome

Reverse transcriptase then adds DNA nucleotides onto the 3-prime end of the primer

Synthesizing DNA complementary of the viral RNA

The temperature and duration of this step depend on the primer, the target RNA and the reverse transcriptase used

Next, an initial denaturation step is applied, causing denaturation of the RNA-DNA hybrids

This step is required for the activation of DNA polymerase

and simultaneously the inactivation of reverse transcriptase

PCR consists of a series of thermal cycles, with each cycle consisting of Denaturation, Annealing, and Extension steps

Denaturation step consists of heating the reaction chamber to 95 degree Celsius.

And it is used for denaturation of the double-stranded DNA template

In the next step

the reaction temperature is lowered to 58 degree Celsius

allowing annealing of the forward primer to its complementary part of the single-stranded DNA template

The annealing temperature relies directly on length and composition of the primers

In the extension step, the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand

complementary to the DNA template strand

by adding free Nucleotides from the reaction mixture that are complementary to the template in the 5' to 3' direction

The temperature at this step depends on the DNA polymerase used

After the first cycle, the double-stranded DNA target is obtained

Then, the denaturation of this double-stranded DNA is performed

yielding two single-stranded DNA molecules

In the next step, the reaction temperature is lowered, allowing annealing of the primers to each of the single-stranded DNA templates

and annealing of the Taq-man probe to its complementary part of the target DNA

TaqMan probe consists of a fluorophore covalently attached to the 5' end of the oligonucleotide probe

the fluorescence is emitted by the fluorophore when is excited by the cycler’s light source

Also, this probe consists of a quencher at the 3' end

The close proximity of the reporter to the quencher prevents detection of its fluorescence

In the extension step, DNA polymerase synthesizes new strands. When the polymerase reaches a TaqMan probe

its endogenous 5' nuclease activity cleaves the probe, separating the dye from the quencher

With each cycle of PCR, more dye molecules are released

resulting in an increase in fluorescence intensity proportional to the amount of amplicon synthesized

This method allows the estimation of the amount of a given sequence present in a sample

The number of double stranded DNA pieces is doubled in each cycle

therefore, PCR can be used to analyze extremely small amounts of sample.

For the measurement of the fluorescence signal

a Tungsten- Halogen lamp

an Excitation filter, Mirrors, lens, an Emission filter

and a Charge-coupled device - CCD camera are used

Filtered light from the lamp is reflected off mirror, passes through a condensing lens, and is focused into the center of each well

then Fluorescent light emitted from the wells reflects off the mirror, passes through an emission filter

and is detected by the CCD camera

In each PCR cycle, Light from excited fluorophore can be detected by the CCD

which converts the light that it captures into digital data

This method is known as real time PCR

which allows the monitoring of the progress of the PCR reaction as it occurs in real time