Coronavirus Test: Real time RT-PCR - Animation video

Biology with Animations

25 Apr 202008:20

Summary

TLDRこのスクリプトは、COVID-19という感染症の検査プロセスについて詳しく説明しています。まず、症状が発症すると、鼻咽頭スワブか口咽頭スワブを使用してサンプルを採取します。次に、RT-PCRという陰性RNAを検出する手法を使って、ウイルスのRNAを特定のDNAフラグメントに変換します。その後、RNAを抽出し、PCRアンプリファイケーションの反応混合物を準備します。その過程で、ターゲット遺伝子を増幅し、リアルタイムRT-PCRを使用してウイルスの存在を検出します。この手法は、非常に少量のサンプルでも分析が可能であり、PCRの進行状況をリアルタイムで監視できます。

Takeaways

🦠 COVID-19は、重度急性呼吸症候群コロナウイルス2によって引き起こされる感染症です。
🤒 感染した場合、最も一般的な症状は発熱、咳、呼吸困難です。
🧪 検査を始めるには、鼻咽頭スワブまたは口咽頭スワブを使用してサンプルを収集します。
📍 鼻咽頭スワブでは、スワブが鼻孔に挿入され、ナゾファリンクスに向かって前へ移動してウイルスを含む分泌液を収集します。
🧬 PCR（聚合酶連鎖反応）は、分子生物学で特定のDNAフラグメントを大量に複製するために広く使用される標準的なコロナウイルス検査方法です。
🧬 コロナウイルスには非常に長い単一鎖RNAゲノムがあり、RT-PCRを使用してこれらのウイルスを検出するために、RNA分子を補完DNAシーケンスに変換する必要があります。
🧪 RNAを抽出するには、商用キットを使用して、サンプルをマイクロセントリファッジチューブに加え、溶離バッファと混ぜます。
🧲 スピンコラムを使用したRNAの純化では、RNA分子は最適な塩濃度とpH条件下でシリカゲル膜に結合し、他の汚染物は留まりません。
🧪 PCRアンプリフィケーションのための反応混合物の準備では、バッファ、逆転スクリプト酶、塩基、前向きプライマー、逆向きプライマー、TaqManプローブ、DNAポリメラーゼが含まれるマスターミックスが使用されます。
🔬 リアルタイムRT-PCRは、RdRp遺伝子、E遺伝子、N遺伝子のターゲットシーケンスの増幅によって新型コロナウイルス2019を検出するために使用されます。
🔬 タクママンプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの5'末端に結合された蛍光物とクエンチャーで構成されており、プローブがDNAポリメラーゼによって切断されると、蛍光物はクエンチャーから分離され、蛍光を発します。
📈 PCRの各サイクルで、TaqManプローブの荧光が増加し、その強度は増幅されたアムプリコンの量に比例します。これにより、非常に少量のサンプルを分析することができます。

Q & A

COVID-19はどのような疾患を引き起こす感染症ですか？
-COVID-19は、重度急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によって引き起こされる感染症です。
COVID-19に感染した場合、最も一般的な症状は何ですか？
-感染した場合、最も一般的な症状は発熱、咳嗽、および呼吸困難です。
COVID-19の検査で使用される2つの主要な検体収集方法は何ですか？
-COVID-19の検査で使用される2つの主要な検体収集方法は、鼻腔後部スワブと口腔後部スワブです。
RT-PCRとは何ですか？
-RT-PCRは、RNA分子を補完的なDNAシーケンスに変換し、その後標準的なPCR手順で増幅する手法であり、広く分子生物学で使用されています。
PCR増幅の前に、検体のRNAをどのように抽出するのですか？
-RNAを抽出するために、商业的なキットを使用して、検体をマイクロセントリフュージュチューブに加え、リンシスバッファと混ぜ合わせます。その後、pulse-vortexingを行い、室温で保温してウイルスをリンシスします。その後、スピンコロンで純化手順を行い、RNAを結晶シリカに結合させ、不純物を除去します。
PCR反応混合物の準備で使用されるマスターミックスとは何ですか？
-マスターミックスは、バッファ、逆転スクリプト酶、塩基、前向きプライマー、逆向きプライマー、TaqManプローブ、およびDNAポリメラーゼを含む、PCR増幅用の前混合された濃縮液です。
リアルタイムRT-PCRとは何ですか？
-リアルタイムRT-PCRは、RdRp遺伝子、E遺伝子、およびN遺伝子内の標的シーケンスの増幅を使用して、新しいコロナウイルス2019を検出するための手法です。
RT-PCRの最初のステップである逆転録とは何ですか？
-逆転録は、PCRの逆転スクリプト用プライマーを使って、ウイルスRNA遺伝子の補完部分に結合し、そのプライマーの3'末端にDNA核苷酸を加えることで、ウイルスRNAに補完するDNAを合成するプロセスです。
PCRサイクルのデンアトレーションステップは何を行いますか？
-デンアトレーションステップは、反応室内を95℃に加熱し、二重結合DNAテンプレートを解離することで、DNAポリメラーゼを活性化し、同時に逆転スクリプト酶を失活させます。
TaqManプローブとは何ですか？また、どのように機能しますか？
-TaqManプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの5'末端に共价的に結合されたフオロフォアを持つもので、フオロフォアがサイクルの光源で興奮すると蛍光を放出します。また、3'末端にはクエンチャーが存在し、フオロフォアの蛍光を検出できないようにします。DNAポリメラーゼがプローブに到達すると、その内蔵の5'クレアセアゼ活性でプローブを切断し、染料をクエンチャーから分離させます。これにより、PCRの各サイクルで、より多くの染料分子が放出され、増幅子合成量に比例する蛍光強度の増加が得られます。
リアルタイムPCRで使用される蛍光信号の測定にはどのような部品が必要ですか？
-リアルタイムPCRで蛍光信号を測定するためには、タングステン-ハロゲンランプ、興奮フィルター、鏡、レンズ、放出フィルター、およびチャージカップルドevice (CCD) カメラが必要です。