Illumina MiSeq: Denature and Dilute Libraries

Summary

En este video, se muestra cómo denaturar y diluir bibliotecas preparadas para secuenciación en el sistema Illumina MiSeq, siguiendo el protocolo de denaturación y dilución MySeq. Se utiliza un kit de reactivo MySeq V3 y se prepara y se añade una biblioteca de control para uso como control de secuenciación. Se detallan los materiales necesarios y los pasos para preparar y mezclar la biblioteca denaturada con el control PhiX, con una concentración de carga de 20 picomolar y una dilución adicional si es necesario. La biblioteca denaturada y diluida puede almacenarse hasta 3 semanas a temperaturas bajas.

Takeaways

• 🧬 El video enseña cómo denaturar y diluir bibliotecas preparadas para secuenciación en el sistema Illumina MiSeq.
• 📚 Se sigue el protocolo de denaturación y dilución para el kit de reactivo MiSeq Reagent Kit v3.
• 🧪 Se necesitan varios componentes, incluyendo el control Illumina 5x v3, el HT1 Buffer, NaOH, Tris-HCl y agua de laboratorio.
• ❄️ El HT1 Buffer debe ser descongelado y almacenado a temperatura ambiente antes de diluir las bibliotecas denaturadas.
• 💧 Se prepara una dilución fresca de 0.2N NaOH combinando agua y NaOH concentrado.
• 🌡️ La biblioteca se denatura mezclando con NaOH y se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos.
• 🔬 Para diluir la biblioteca denaturada, se añade HT1 Buffer precalentado, resultando en una biblioteca a 20 picomolar.
• 📏 No se necesita más dilución si la concentración de carga deseada es de 20 picomolar.
• 🧫 Se diluye el control PhiX combinándolo con Tris-HCl y el control Illumina 5x.
• 🔄 El control PhiX también se denatura y se diluye con HT1 Buffer, resultando en una biblioteca a 20 picomolar.
• 🕰️ La biblioteca denaturada y diluida de PhiX puede almacenarse hasta 3 semanas a temperaturas entre -15 y -25°C.
• 📦 Se combina la biblioteca denaturada y diluida con el control PhiX para la secuenciación, usando una proporción del 1% en volumen.

Q & A

¿Qué sistema de secuenciación se utiliza en el video para el procesamiento de las librerías?

El sistema de secuenciación utilizado en el video es el Illumina MiSeq.

¿Cuál es el propósito de la librería preparada que se muestra en el video?

La librería preparada se utiliza para la secuenciación en el sistema Illumina MiSeq, siguiendo el protocolo de denaturación y dilución para el kit de reactivo MiSeq Reagent Kit v3.

¿Qué kit de reactivo se utiliza para la denaturación y dilución de las librerías en el video?

Se utiliza el MiSeq Reagent Kit v3 para la denaturación y dilución de las librerías en el video.

¿Qué temperaturas se sugieren para almacenar el HT1 Buffer después de su descongelación y antes de diluir las librerías denaturadas?

Después de descongelar, el HT1 Buffer debe almacenarse a temperaturas entre 2 y 8 grados Celsius hasta que estés listo para diluir las librerías denaturadas.

¿Cuál es la concentración inicial de la librería pool utilizada en el video para comenzar el proceso de denaturación y dilución?

La concentración inicial de la librería pool utilizada en el video es de 4 nanomolar.

¿Cómo se combina el ácido naoh para crear una solución de 0.2 normal para la denaturación de la librería?

Para preparar una dilución fresca de 0.2 normal de ácido naoh, se combina 800 microlitros de agua de laboratorio con 200 microlitros de ácido naoh de stock 1.0 normal.

¿Cuánto tiempo se debe incubar la librería denaturada a temperatura ambiente después de combinarla con el ácido naoh?

La librería denaturada debe incubarse a temperatura ambiente durante 5 minutos después de combinarla con el ácido naoh.

¿Cómo se diluye la librería denaturada con el HT1 Buffer para obtener una solución de 20 picomolar?

Para diluir la librería denaturada, se agregan 990 microlitros de HT1 Buffer precalentado a la librería y se mezcla invertiendo el tubo.

¿Qué se necesita para preparar y agregar una librería de control fx para usar como control de secuenciación en el video?

Para preparar y agregar una librería de control fx, se necesita el Illumina 5x Control v3, el HT1 Buffer, el ácido naoh de 1.0 normal, el tris-HCl a 10 milimolar a pH 8.5 con 0.1 Tween20 y agua de laboratorio.

¿Cuánto tiempo puede almacenarse la librería de control fx denaturada y diluida a temperaturas entre -15 y -25 grados Celsius?

La librería de control fx denaturada y diluida puede almacenarse hasta por 3 semanas a temperaturas entre -15 y -25 grados Celsius.

¿Cómo se combina la librería denaturada y diluida con el control fx para usarlo como control de secuenciación?

Para incluir el control fx en un porcentaje del 1% en volumen, se combina 594 microlitros de la librería denaturada y diluida con 6 microlitros de la librería de control fx denaturada y diluida, y se mezcla invertiendo.