Agarose Gel Electrophoresis - Animated Video

Summary

La electroforesis en gel de agarosa es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN u otras macromoléculas como ARN y proteínas según su tamaño y carga. Se prepara el gel con polvo de agarosa y se calienta hasta disolverse. Se enfríe y se añade etidio bromuro, un agente intercalante tóxico que fluoresce bajo luz ultravioleta, permitiendo visualizar las bandas de ADN. Se carga el gel con muestras y se somete a corriente eléctrica, separando los fragmentos según su tamaño. Finalmente, la gel se expone a luz UV para observar las bandas de ADN, comparándolas con una escala de referencia para determinar sus longitudes.

Takeaways

• 🧪 El electroforesis en gel de agarosa es una técnica para separar fragmentos de ADN u otras macromoléculas como ARN y proteínas según su tamaño y carga.
• 🌡 La preparación del gel es crucial, y el agarosa debe disolverse a una temperatura de aproximadamente 55 °C antes de verterlo en el tanque de electroforesis.
• 🔬 Los fragmentos de ADN más grandes se resuelven mejor en un gel de baja concentración, mientras que los más pequeños en uno de alta concentración.
• 🚫 El etidio bromuro, un agente intercalante, es altamente tóxico y debe manipularse con precaución en un armario de gases.
• 🌌 Al exponerse a la luz ultravioleta, el etidio bromuro hace que las bandas de ADN se iluminen, permitiendo su visualización.
• 🎚️ El electroforesis requiere un tanque con electrodos negativos y positivos, y un gel con ranuras para cargar las muestras.
• 🏺 El buffer TAE o TBE es esencial para proporcionar iones que lleven corriente y mantener un pH constante durante la electroforesis.
• 🧬 Se utiliza una solución de carga para agregar densidad a las muestras de ADN, facilitar su descenso en el gel y monitorizar su progreso.
• 📏 Se carga una referencia de tamaño molecular, conocida como escalera de ADN, para comparar y determinar los tamaños aproximados de las bandas de ADN.
• ⚡️ La aplicación de una corriente eléctrica hace que las moléculas de ADN, con carga negativa, se muevan hacia el polo positivo en el gel.
• 🌌 Las bandas de ADN resultantes en el gel son visibles bajo luz UV y representan fragmentos de ADN de tamaños similares que se han movido juntos.

Q & A

¿Qué técnica se utiliza para separar fragmentos de ADN u otras macromoléculas como ARN y proteínas según su tamaño y carga?

La técnica utilizada es la electroforesis en gel de agarosa.

¿Cuál es el primer paso en la separación de fragmentos de ADN?

El primer paso es la preparación del gel o la fabricación del gel.

¿Qué tipo de gel se utiliza para resolver mejor las moléculas más grandes en electroforesis de agarosa?

Para resolver mejor las moléculas más grandes se utiliza un gel de baja concentración.

¿Cómo se prepara la solución de agarosa antes de verterla en el tanque de electroforesis?

Se calienta la solución de agarosa en un microondas hasta que se disuelva completamente y luego se enfríe a aproximadamente 55 grados Celsius en un baño de agua.

¿Qué es el propósito de agregar etidio bromuro al gel de agarosa?

El etidio bromuro es un agente de intercalación que se intercala entre pares de bases de la molécula de ADN, permitiendo que las bandas de ADN se vean al exponerlas a luz ultravioleta.

¿Por qué es necesario manejar con cuidado el etidio bromuro durante la electroforesis de agarosa?

El etidio bromuro es altamente tóxico y mutagénico, por lo que debe manipularse con precaución, generalmente en un hood de gas.

¿Qué es un 'tanque de electroforesis' y cómo se prepara para la fabricación del gel?

Un tanque de electroforesis es un contenedor con electrodos negativos y positivos donde se prepara el gel. Se coloca una malla para crear surcos para cargar muestras y se fijan barreras de moldeo para evitar que la solución de agarosa se derrame durante el enfriamiento.

¿Qué es un 'marcador de tamaño molecular' y cómo se utiliza en la electroforesis de agarosa?

Un marcador de tamaño molecular, también conocido como escalera de ADN, es una referencia estándar que contiene fragmentos de ADN de longitudes conocidas. Se carga en el primer surco del gel de agarosa para comparar y determinar los tamaños aproximados de las muestras de ADN.

¿Qué es la carga de los fragmentos de ADN y cómo afecta su movimiento a través del gel durante la electroforesis?

Los fragmentos de ADN tienen una carga negativa debido a los grupos fosfato en su esqueleto de azúcar-fosfato. Por lo tanto, cuando se colocan en un campo eléctrico, los fragmentos de ADN se mueven hacia el polo positivo.

¿Cómo se pueden ver las bandas de ADN después de la separación en la electroforesis de agarosa?

Después de la separación, el gel se coloca bajo luz ultravioleta, lo que permite ver las bandas de fragmentos de ADN, cada una conteniendo una gran cantidad de fragmentos de ADN del mismo tamaño que han viajado juntos a la misma posición.

Outlines

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🧬 Preparación de Gel de Agarose para Electroforesis de ADN

El electroforesis en gel de agarosa es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN, ARN y proteínas según su tamaño y carga. Se inicia con la preparación del gel, donde se pesa la cantidad adecuada de polvo de agarosa y se añade un buffer como TAE o TBE. El agarosa se disuelve al calentar en un microondas y luego se enfríe a 55 °C. Mientras se enfría, se prepara el tanque de electroforesis con un negativo y un positivo, colocando un comb para crear wells para las muestras. Se añade etidio bromuro, un agente intercalante tóxico que fluoresce bajo luz ultravioleta, permitiendo visualizar las bandas de ADN. Posteriormente, se verter el agarosa en el tanque y se deja solidificar. Se sumerge el gel en un buffer de corriente y se preparan las muestras de ADN con un buffer de carga, que agrega densidad y facilita la carga en el gel. Se cargan las muestras y se aplica una corriente eléctrica para que los fragmentos de ADN se muevan hacia el polo positivo. Los fragmentos de ADN, cargados negativamente, se mueven a diferentes velocidades según su tamaño. La electroforesis se detiene antes de que el colorante migre completamente, y finalmente, las bandas de ADN se observan bajo luz UV.

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🔍 Determinación del Tamaño de Fragmentos de ADN

Una vez separados los fragmentos de ADN en el gel de agarosa, se compara la posición de las bandas de las muestras con una escala de referencia conocida como escalera de ADN. Esta escala contiene fragmentos de ADN de longitudes conocidas que se cargan en el primer well del gel. La comparación permite determinar aproximadamente el tamaño de los fragmentos de ADN en las muestras, ya que los fragmentos más pequeños migran más rápido y aparecen más cerca del polo negativo, mientras que los más grandes se mueven más lentamente y se ubican más cerca del polo positivo.

Highlights

Agarose Gel electrophoresis is used to separate DNA fragments or other macromolecules based on size and charge.

Larger DNA molecules are resolved better using a low concentration gel.

Smaller DNA molecules separate better at high concentration gels.

Agarose powder is weighed out for gel preparation.

A buffer like TAE or TBE is added to the agarose powder.

Agarose must be heated to dissolve it in the buffer.

The agarose solution is cooled to about 55 degrees Celsius before use.

An electrophoresis tank with electrodes is prepared for gel casting.

Ethidium bromide is added to the agarose solution for DNA visualization under UV light.

Ethidium bromide is a mutagen and must be handled with care in a fume hood.

DNA samples are prepared with a loading buffer for density and color.

A DNA ladder of known lengths is used as a molecular-weight size marker.

DNA fragments move towards the positive pole in an electric field due to their negative charge.

Smaller DNA fragments move faster through the gel than larger ones.

Bromophenol blue migrates faster than DNA and is used to stop electrophoresis before samples exit the gel.

DNA fragments are visualized as bands under UV light after separation.

DNA bands can be compared to the DNA ladder to determine their approximate sizes.

Transcripts

Agarose Gel electrophoresis is a technique

used to separate DNA fragments or other macromolecules

such as RNA and proteins based on their size and charge

The first step for DNA fragments separation

is the gel preparation or gel Casting

An appropriate amount of agarose powder is weighed out

For standard agarose gel electrophoresis

larger molecules are resolved better using a low concentration gel

while smaller molecules separate better at high concentration gel

Once the agarose has been weighed

an appropriate buffer such as TAE or TBE is poured into the bottle

agarose does not dissolve until it is heated

Therefore, the solution is heated for few seconds in a microwave oven

Once the agarose is fully dissolved

the solution is cooled to about 55 degrees Celsius in a water bath

While the agarose solution is cooling

an electrophoresis tank, with a negative electrode and a positive electrode is prepared for gel casting

A comb is placed in the tank to create wells for loading samples

then casting dams are fixed in the tank

so that the agarose solution does not flow out during setting

once the agarose solution has cooled to about 55 degrees celsius

and before pouring it, into the electrophoresis tank, ethidium bromide is added

ethidium bromide is highly toxic as a mutagen

so it must be carefully handled in a fume hood

Ethidium bromide is an intercalating agent

which intercalates between base pairs of the DNA molecule

When it is exposed to ultraviolet light, it will fluoresce

and DNA bands become visible

The more DNA present, the brighter the band

after addition of ethidium bromide

the agarose solution is poured into the electrophoresis tank

then, the gel is allowed to solidify at room temperature

Once the gel has solidified, the comb is carefully removed

as well as the casting dams

Next, the gel is submerged in a TAE or TBE running buffer

which used to provide ions that carry a current

and to maintain the pH at a relatively constant value

After the preparation of the agarose gel

the next step is the preparation of the DNA samples

A loading buffer is added to each sample

This buffer contains a glycerol and some dyes such as bromophenol bleu

And it is used to add density to the sample, allowing it to sink into the gel

to provide color and simplify the loading process

and to allow the user to monitor the progress of the separation

before loading the samples into the wells

a molecular-weight size marker known as a DNA ladder

is commonly used as a standard reference that contains DNA fragments of known lengths

it is loaded into the first well of the agarose gel

Once the molecular-weight size marker has been loaded

the DNA samples are loaded into the wells

After adding the samples into the wells

a lid is placed on the electrophoresis tank

Then, an electric current is applied to pull the samples through the gel

Based on their charge and size

the DNA molecules will travel through the gel at different speeds

The DNA molecules have a negative charge

because of the phosphate groups in their sugar-phosphate backbone

herefore, when placed in an electric field

DNA fragments start moving through the matrix of the gel towards the positive pole

Because all DNA fragments have the same amount of charge per mass

small fragments move through the gel faster than large ones

Due to the relatively small molecule size of bromophenol blue, it migrates faster than DNA

and by optical control of the migrating-colored band, the electrophoresis can be stopped before the dye

so before the samples have completely migrated through the gel and leave it

Once the DNA fragments have been separated

the gel is placed under UV light

Then, the DNA fragments can be seen as bands.

Each band contains a large number of DNA fragments of the same size

that have all traveled as a group to the same position

By comparing the DNA bands of the samples to the DNA ladder

we can determine their approximate sizes