ELECTROFORESIS de ADN en GEL de AGAROSA [TEÓRICO y PRÁCTICO]
Summary
TLDREl vídeo explica la técnica de electroforesis, utilizada para separar moléculas como ADN, ARN o proteínas según su tamaño y carga eléctrica en un campo eléctrico. Se enfoca en la electroforesis en gel de agarosa, donde las moléculas de ADN se separan según su longitud en pares de bases. Se detalla el proceso de preparación del gel, la incorporación de bromuro de tibio, la carga de muestras y marcadores de peso molecular, y la corrida del gel. Finalmente, se visualizan las bandas de ADN en un transiluminador UV, permitiendo determinar su tamaño y comprobar la eficacia de técnicas como la PCR.
Takeaways
- 🔬 Electroforesis es una técnica utilizada para separar moléculas en base a su tamaño y carga eléctrica en un campo eléctrico.
- 🧬 Los científicos aplican electroforesis para separar ADN, ARN y proteínas en el laboratorio.
- 📊 La electroforesis en gel de agarosa es una forma específica de esta técnica que permite la separación de moléculas a través de una matriz porosa.
- ⚡️ Los ácidos nucleicos, debido a su estructura con grupos fosfato, tienen una carga negativa y migran hacia el ánodo en la electroforesis.
- 🔑 La velocidad de migración de las moléculas en el gel se ve influenciada por la fuerza eléctrica y la fuerza de rozamiento.
- 🌐 La fuerza de rozamiento es directamente proporcional al tamaño y forma de la molécula, y a las características del medio como la viscosidad.
- 🧪 El ADN de doble cadena en una solución acuosa no se separa eficientemente debido a la baja fricción, lo que requiere el uso de un medio soporte como el gel.
- 🌀 Los gels de agarosa y poliacrilamida son comunes en laboratorios para proporcionar una red molecular que aumenta la fricción y reduce la difusión.
- 📏 La elección del porcentaje de agarosa en el gel afecta el tamaño del poro y, por ende, la separación de fragmentos de ADN de diferentes longitudes.
- 🔎 Los marcadores de peso molecular son esenciales para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN durante la electroforesis, permitiendo comparar y estimar longitudes.
Q & A
¿Qué es la electroforesis y para qué se utiliza?
-La electroforesis es una técnica que sirve para la separación de moléculas según su movilidad en un campo eléctrico. Se utiliza en el laboratorio para separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica.
¿En qué dirección migran los ácidos nucleicos durante la electroforesis?
-Los ácidos nucleicos, debido a su carga negativa, migran hacia el polo positivo, es decir, hacia el ánodo.
¿Qué fuerzas afectan la velocidad de las partículas en la electroforesis?
-Las partículas en la electroforesis están sujetas a dos fuerzas de acción opuestas: la fuerza eléctrica que atrae a la partícula hacia el electrodo y la fuerza de rozamiento que se opone a su migración.
¿Cómo se relaciona la carga y el tamaño de una molécula con su migración en el gel durante la electroforesis?
-Cuanta más carga y menor masa tenga la molécula, más rápido migrará a través del gel. Por otro lado, más pequeña y flexible sea la molécula, más rápido emigrará.
¿Qué es un gel de agarosa y cómo se utiliza en la electroforesis?
-Un gel de agarosa es una matriz porosa utilizada en la electroforesis para separar macromoléculas. Aumenta la fricción recibida por las macromoléculas y reduce la difusión, permitiendo una separación eficiente.
¿Cómo se prepara una solución de agarosa para el gel de electroforesis?
-Se mezcla agarosa con buffer de corrida y se calienta en microondas hasta que la agarosa se disuelva. Se agrega bromuro de tibio para visualizar el ADN más tarde.
¿Qué es un marcador de peso molecular y cómo se utiliza en la electroforesis?
-Un marcador de peso molecular es una mezcla de fragmentos de ADN de tamaño conocido que se utiliza para comparar las muestras en la corrida y determinar el tamaño de los fragmentos de ADN en las muestras.
¿Cuál es el propósito de agregar bromuro de tibio al gel de agarosa?
-El bromuro de tibio es un intercalante del ADN que permite visualizar las moléculas de ADN una vez que el gel es expuesto a luz ultravioleta, ya que se torna fluorescente.
¿Cómo se determinan los tamaños de los fragmentos de ADN en una electroforesis en gel de agarosa?
-Se compara la distancia migrada por los fragmentos de ADN con la del marcador de peso molecular en paralelo, lo que permite estimar el tamaño de los fragmentos en la muestra incógnita.
¿En qué áreas tiene aplicación la electroforesis en gel de agarosa?
-La electroforesis en gel de agarosa tiene múltiples aplicaciones en la medicina, genética, biotecnología, ingeniería genética y en el ámbito forense y en el reconocimiento de personas.
Outlines
🔬 Introducción a la Electroforesis
El primer párrafo introduce la técnica de la electroforesis, que es utilizada para separar moléculas en un campo eléctrico según su tamaño y carga eléctrica. Se explica que los científicos la emplean para separar ADN, ARN o proteínas. Se menciona que en el vídeo se verá la electroforesis en gel de agarosa, un método que permite observar la migración de moléculas hacia el polo positivo (ánodo) en una matriz porosa. Se destaca que la velocidad de migración de las moléculas está influenciada tanto por la fuerza eléctrica como por la fuerza de rozamiento, dependiendo de su tamaño y forma. Además, se menciona que los ácidos nucleicos, debido a su estructura, tienen una carga negativa y migran hacia el ánodo. Se describe cómo la electroforesis se utiliza para separar macromoléculas en laboratorio, y cómo el tamaño y la forma de las moléculas afectan su migración a través del gel.
🧪 Preparación y Ejecución de la Electroforesis en Gel de Agarosa
El segundo párrafo detalla el proceso de preparación y ejecución de la electroforesis en gel de agarosa. Se describe cómo se prepara el gel, incluyendo la elección del porcentaje de agarosa para regular el tamaño del poro y la adición de bromuro de tibio como intercalante para visualizar el ADN. Se explica que el porcentaje de agarosa en el gel afecta la velocidad de migración de los fragmentos y cómo se puede observar la diferencia en los fragmentos más pequeños. Seguidamente, se describe el proceso de sembrar las muestras en el gel, incluyendo la preparación de las muestras con buffer de siembra y la carga de estas en el gel. También se menciona la utilización de un marcador de peso molecular para comparar y determinar el tamaño de los fragmentos de ADN. Finalmente, se describe cómo se realiza la electroforesis, conectando la fuente de la cuba y corriendo el gel hasta que el colorante del buffer de siembra haya migrado lo suficiente.
📸 Análisis y Aplicaciones de la Electroforesis
El tercer párrafo se centra en el análisis y las aplicaciones de la electroforesis. Se describe cómo, una vez finalizada la electroforesis, el gel se expone a luz ultravioleta para visualizar los fragmentos de ADN mediante el bromuro de tibio fluorescente. Se menciona que la fotografía de la electroforesis muestra fragmentos separados según su longitud, permitiendo la identificación de una banda correspondiente al fragmento de interés. Además, se destaca la utilidad de la electroforesis en áreas como la medicina, la genética, la biotecnología, la ingeniería genética y el ámbito forense. Finalmente, se hace un llamado a la audiencia para que si les resultó útil el contenido, den like y se suscriban al canal para recibir más información.
Mindmap
Keywords
💡Electroforesis
💡ADN y ARN
💡Gel de agarosa
💡Fuerza eléctrica y fuerza de rozamiento
💡Carga y masa
💡Marcador de peso molecular
💡Buffer de siembra
💡Transiluminador UV
💡PCR
💡Bromuro de tibio
Highlights
Electroforesis es una técnica utilizada para separar moléculas según su movilidad en un campo eléctrico.
Los científicos usan electroforesis para separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en función de su tamaño y carga eléctrica.
La electroforesis en gel de agarosa se utiliza para observar la migración de moléculas a través de una matriz porosa.
Los ácidos nucleicos, debido a su esqueleto de grupos fosfato, tienen una carga negativa y migran hacia el polo positivo (ánodo).
La velocidad de migración de una molécula en la electroforesis está influenciada por la fuerza eléctrica y la fuerza de rozamiento.
Moléculas con más carga y menor masa migran más rápido en la electroforesis.
Moléculas más pequeñas y flexibles pueden pasar más rápidamente entre los poros del gel.
La electroforesis se utiliza para separar macromoléculas en forma analítica o preparativas.
Los ácidos nucleicos tienen un fosfato cargado negativamente por cada nucleótido, y su relación carga-masa es independiente de la secuencia y tamaño de la molécula.
La separación de moléculas de ADN de doble cadena en una electroforesis depende de su tamaño y longitud en pares de bases.
Para una separación eficiente de moléculas en electroforesis, se utiliza un medio soporte como un gel que aumenta la fricción y reduce la difusión.
Los gels de polímero orgánico como la agarosa o la poliacrilamida son usados en laboratorios para su consistencia gelatinosa y estabilidad.
La preparación del gel de agarosa incluye el regulado del porcentaje de agarosa para controlar el tamaño del poro y la velocidad de migración de las moléculas.
El bromuro de tibio se agrega al gel para visualizar las moléculas de ADN durante la electroforesis.
Las muestras se mezclan con un buffer de siembra para darles densidad y facilitar su carga en el gel durante la electroforesis.
Los marcadores de peso molecular son utilizados para comparar y determinar el tamaño de los fragmentos de ADN en la electroforesis.
La electroforesis se realiza conectando la fuente de la cuba y corriendo el gel hasta que el colorante del buffer de siembra haya migrado lo suficiente.
El transiluminador UV permite visualizar la posición de los fragmentos de ADN en el gel después de la electroforesis.
La electroforesis tiene múltiples aplicaciones en la medicina, genética, biotecnología, ingeniería genética y en el ámbito forense.
Transcripts
electroforesis es una técnica que sirve
para la separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo eléctrico
los científicos la usan en el
laboratorio para separar moléculas de
adn arn o proteínas en base a su tamaño
y carga eléctrica
en el vídeo de hoy vamos a ver la
electroforesis en gel de agarosa
bienvenidos a una nueva edición de nutri
mente
a diferencia de las proteínas las cuales
pueden tener una carga neta positiva o
negativa los ácidos nucleicos están
cargados de forma negativa debido a su
esqueleto de grupos fosfato por lo tanto
en una electroforesis los ácidos
nucleicos migran hacia el polo positivo
es decir hacia el ánodo
al desplazarse a través de una matriz
porosa como por ejemplo un gel de
agarosa las moléculas de adn son
sometidas a dos fuerzas de acción
opuestas que determinan la velocidad de
la partícula en cuestión por un lado la
fuerza eléctrica que le atrae al
electrodo cuya intensidad es
directamente proporcional a la carga y
de acuerdo a la segunda ley de newton
les impone una aceleración directamente
proporcional al cociente carga masa por
otro lado la fuerza de rozamiento que se
opone a la emigración con una intensidad
que depende del tamaño y la forma de la
partícula y de las características del
medio por ejemplo la viscosidad y la
estructura
pasando en limpio cuanta más carga y
menor masa tenga la molécula más rápido
va a migrar a través del gel y cuanto
más pequeña sea la molécula y tenga una
forma más flexible o capaz de pasar
entre los poros del gel más rápido
emigrará por el contrario cuanta menos
carga tenga y más grande sea más le
costará pasar por entre los poros del
gel y migrar a más lentamente la
electroforesis se utiliza en el
laboratorio para separar macromoléculas
en solución en forma analítica es decir
sólo para verlas o preparativas para
purificar las
los ácidos nucleicos tienen un fosfato
cargado negativamente por cada
nucleótido como el peso molecular de los
cuatro nucleótidos es similar
la relación carga masa es independiente
de la secuencia y el tamaño de la
molécula por lo tanto la aceleración
impuesta por la fuerza eléctrica es
igual para cualquier molécula de ácido
nucleico la única diferencia en
velocidad de migración estará dada por
diferencias en la fuerza de rozamiento o
sea de su forma y de su tamaño en el
caso del adn de doble cadena suponiendo
por ejemplo que todas las moléculas son
fragmentos lineales la forma es la misma
para cualquier molécula entonces las
distintas moléculas tendrán una
velocidad que solo dependerá de su
tamaño es decir de su longitud en pares
de bases
sin embargo si tratáramos de separar
moléculas de adn de doble cadena en una
electroforesis en una solución acuosa
nos encontraríamos con que el rozamiento
impuesto por ésta es tan pequeño que
todas las moléculas migrarían juntas
además durante el electroforesis las
moléculas se separarían unas de otras
por difusión impidiendo el análisis para
lograr una separación eficiente se
utiliza un medio soporte que aumente
considerablemente la fricción recibida
por las macromoléculas y reduzca la
difusión a un mínimo este medio suele
ser una red molecular de algún polímero
orgánico conocida como gel por su
consistencia gelatinosa los más
utilizados en el laboratorio de biología
molecular son de pollo acrilamida una
red molecular estabilizada por uniones
covalentes y agarosa un derivado del
agar agar un polisacárido extraído de un
alga que al disolverlo forma una red
estabilizada por interacciones no
covalentes
las mezclas de adn es de distinto tamaño
se hace en migrar o correr en la jerga
de laboratorio a través del gel durante
un cierto tiempo y se obtiene una
separación en la que la distancia
emigrada por una molécula dada es
inversamente proporcional a su longitud
en pares de bases el tamaño de una
muestra incógnita puede estimarse
corriendo en paralelo muestras de
longitud conocida cuando se hace un
análisis selector poético de muestras de
ácidos nucleicos que no poseen todas la
misma forma debido por ejemplo a la
presencia de estructuras secundarias que
dependen del apareamiento interno o sea
de la secuencia ya sea a rn o adn simple
cadena es necesario para determinar su
peso molecular homogeneizar su
estructura para ello se utilizan agentes
desnaturalizan test fuertes que
destruyen la estructura secundaria
habiendo visto la teoría ahora vamos al
laboratorio virtual a ver la parte
práctica supongamos que partimos de unas
muestras de adn que obtuvimos luego de
la amplificación tras una pcr como la
que vimos en el vídeo anterior de esta
serie después de la pcr necesitamos ver
si efectivamente el gen de interés
estaba en la muestra de adn templado y
corroborar que el tamaño del fragmento
amplificado coincida con lo buscado para
esto vamos a hacer una electroforesis en
gel de agarosa
primero tenemos que preparar la solución
de agarosa para hacer el gel regulando
el porcentaje de agarosa en el gel se
puede regular el tamaño del poro a mayor
porcentaje de agarosa obtenemos un poro
más chico en este caso todos los
fragmentos migran más lentamente pero
podremos observar diferencias de pocas
bases en los fragmentos más chicos con
geles de poliamida de poro aún más chico
que la agarosa pueden verse diferencias
e incluso de una base
por otro lado a menor porcentaje de
agarosa obtenemos un poro más grande y
todos los fragmentos chicos correrán más
rápidamente pero podremos resolver
fragmentos de más alto peso molecular
en este caso vamos a hacer un gel 2% más
en volumen para esto vamos a pensar en
una balanza un gramo de agarosa que es
un polvo y lo vamos a poner en un vaso
de precipitado con 50 mililitros de
buffer de corrida que puede ser buffer
tve o tae 1 x para saber más sobre
soluciones y concentraciones puedes ver
el vídeo correspondiente de esta serie
vamos a incubar la solución en el
microondas para fundir la garza en el
buffer cuando la solución se encuentre
fundida se agrega una muy pequeña
cantidad de bromuro de tibio que es un
intercalan té del adn es decir una
molécula que se introduce entre las
hebras de adn y nos va a permitir
visualizar las más adelante el pro muro
decidió es un potente carcinógeno por lo
que hay que realizar este paso con
cuidado usando guantes
cuando la solución se encuentra lista se
vuelca en el molde que debe tener un
peine colocado que va a formar los
pocillos en donde vamos a sembrar las
muestras
se espera que solidifique y luego se
retira cuidadosamente el peine y se
quitan los topes de los bordes ya que
éstos deben estar en contacto con el
vaso
se coloca el gel en la cuba de
electroforesis y se agrega suficiente
barrera de corrida para cubrir todo el
gel
teniendo el listón gel ahora tenemos que
preparar las muestras se mezclan por
ejemplo 5 microlitros de muestra con un
micro litro de buffer de siembra 6 por
cargando y descargando con la pipeta
esto se puede hacer en un tubo de pendón
o sobre un papel aluminio formando una
gota y los volúmenes pueden variar de
acuerdo al objetivo de la corrida y la
concentración del buffer de siembra
recordemos que estamos viendo solo un
ejemplo ilustrativo
la función del buffer de siembra es
darle densidad de las muestras para que
caigan al fondo de los pocillos y
generalmente es coloreado para poder ver
dónde está el frente de corrida mientras
se corre el gel una vez lista la muestra
se carga la pipeta con la misma y se
apoya con delicadeza en uno de los
bordes de un pocillo del gel calle en la
jerga o web en inglés se descarga
lentamente la muestra hasta el primer
tope de la pipeta evitando la formación
de burbujas
además de las muestras en cada una de
las calles del gel se siembra un
marcador de peso molecular que es una
mezcla comercial de fragmentos de adn de
tamaño conocido que nos va a permitir
comparar nuestras muestras en la corrida
y determinar el tamaño de los fragmentos
de adn en las mismas
una vez que está el marcador de peso
molecular y todas las muestras sembradas
en cada uno de los pocillos del gel se
conecta la fuente de la cuba con cuidado
de que el polo positivo esté en el lado
opuesto al sitio de siembra y se corre a
voltaje constante cuando se aplica un
campo eléctrico entre los extremos de la
cuba los fragmentos del adn de carga
negativa se desplazan hacia el polo
positivo y se separan de acuerdo a su
tamaño aplicamos el campo eléctrico
hasta que el colorante del buffer de
siembra haya migrado lo suficiente ya
que es nuestro indicador visual para
saber cómo están corriendo las muestras
se apaga la fuente y se coloca el gel
sobre un trans iluminador ub vimos este
equipo en el vídeo de instrumentos de
laboratorio parte 2 de esta serie
la exposición del gel a la luz
ultravioleta hace que el bromuro decidió
que habíamos agregado cuando preparamos
el gel y que está ahora unido al adn se
torna el fluorescente lo cual hace
visible la posición de los fragmentos en
el gen
la fotografía de una electroforesis en
gel muestra fragmentos de adn separados
según sus diferentes longitudes o
números de pares de bases si la muestra
era el resultado de una pcr observaremos
una banda del tamaño correspondiente al
fragmento que amplificamos con esa
técnica para conocer el tamaño del
fragmento se compara con el marcador de
peso molecular que corremos en una de
las calles del gel y en este ejemplo
sería un fragmento de 400 pares de bases
estos fragmentos pueden suficientemente
ser extraídos intactos del gel para
utilizarlos en un procedimiento
posterior o simplemente se observan para
obtener conclusiones
cabe aclarar que existen múltiples
variantes en la realización de esta
técnica y que aquí vivimos en la parte
práctica un ejemplo de cómo se lleva a
cabo como veremos en otros vídeos esto
tiene múltiples aplicaciones en el área
de la medicina la genética la
biotecnología la ingeniería genética y
en el ámbito forense y en el
reconocimiento de las personas
si este vídeo te sirvió para aprender o
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