4.2. Cromatografía de Líquidos
Summary
TLDREn este video, Lucía Guardiola, profesora de la Universidad Católica de Murcia, explica cómo funciona un equipo de HPLC (cromatografía líquida de alta resolución). Se detalla el proceso para identificar, cuantificar y purificar componentes de muestras complejas. La explicación incluye el uso de fases móviles y estacionarias, el papel de los detectores (como el diodo array y la fluorescencia), y la importancia de seleccionar adecuadamente condiciones como la fase móvil, el tipo de columna y los métodos de extracción. Este equipo es esencial en laboratorios de control de calidad para detectar compuestos como vitaminas, proteínas y plaguicidas.
Takeaways
- 👩🏫 La profesora Lucía Guardiola explica conceptos de HPLC (Cromatografía de Alta Presión Líquida).
- 🔍 HPLC se utiliza para identificar, cuantificar y purificar componentes de muestras complejas.
- 💧 En HPLC, se emplea una fase móvil (agua) y una fase estacionaria (modificador orgánico como acetonitrilo y metanol).
- 🚀 La bomba inyecta la muestra a un caudal constante, lo que es crucial para medir tiempos de retención.
- 🧪 La muestra se inyecta en un vial y pasa por una columna cromatográfica donde se separa según su afinidad.
- 🧲 La fase estacionaria, compuesta de sílice unida a grupos hidrocarbonados, interactúa con la muestra.
- 🔎 Se utiliza un detector de diodo array para medir la absorción de radiación electromagnética por los compuestos.
- 🌐 La elección de la fase móvil, la columna y el detector depende de los componentes a analizar.
- 📊 El cromatógrafo muestra picos que representan a los distintos componentes identificados en la muestra.
- 🍊 Por ejemplo, se puede determinar la concentración de vitamina C en zumo mediante comparación con un estándar.
- 🌟 La cromatografía líquida tiene aplicaciones en diversos campos como la agroalimentaria, la farmacéutica y el control de plaguicidas.
Q & A
¿Qué es un equipo de HPLC y para qué sirve?
-Un equipo de HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) es un dispositivo que permite identificar, cuantificar y purificar muestras complejas separando sus distintos componentes. Es esencial en laboratorios de control de calidad, especialmente en industrias alimentarias y farmacéuticas.
¿Cómo funciona la cromatografía en fase reversa?
-La cromatografía en fase reversa utiliza agua y un modificador orgánico como acetonitrilo o metanol. La muestra pasa a través de una columna cromatográfica que contiene una fase estacionaria, lo que permite separar los componentes según su afinidad con la fase estacionaria o móvil.
¿Qué es una fase estacionaria en cromatografía líquida?
-La fase estacionaria es una parte de la columna cromatográfica, compuesta por sílice unida a grupos hidrocarbonados. Los componentes de la muestra pueden quedar retenidos en esta fase según su afinidad, lo que permite su separación de otros compuestos.
¿Cuál es el rol de la fase móvil en la cromatografía líquida?
-La fase móvil es el líquido que se utiliza para transportar la muestra a través de la columna cromatográfica. Si un componente es más afín a la fase móvil, pasará rápidamente por la fase estacionaria. En fase reversa, la fase móvil puede estar compuesta por agua y un modificador orgánico.
¿Cómo se detectan los componentes de una muestra en la cromatografía líquida?
-La detección en cromatografía líquida se realiza mediante detectores que aprovechan propiedades físicas del compuesto o de la fase móvil. Un detector común es el diodo array, que mide la absorción de radiación electromagnética de los compuestos al pasar a través de una longitud de onda específica.
¿Qué tipo de detectores se utilizan en la cromatografía líquida?
-Se utilizan varios tipos de detectores, como el diodo array, que es un detector UV-visible universal, y los detectores de fluorescencia, que son más selectivos pero solo funcionan con compuestos fluorescentes.
¿Qué información nos proporciona un cromatograma?
-Un cromatograma muestra los picos cromatográficos de los distintos componentes de la muestra. Cada pico corresponde a un componente que ha sido separado en la columna, indicando el tiempo que tardó en salir y su área, lo que ayuda a identificar y cuantificar los componentes.
¿Cómo se correlaciona un pico cromatográfico con un compuesto específico?
-Para identificar un compuesto, se utiliza un estándar de concentración conocida. Si un pico en la muestra aparece al mismo tiempo que el del estándar, y su área es similar, se puede correlacionar ese pico con el compuesto estándar.
¿Qué aplicaciones tiene la cromatografía líquida en la industria alimentaria?
-En la industria alimentaria, la cromatografía líquida se utiliza para detectar vitaminas, proteínas, aditivos, micotoxinas, y plaguicidas en bajas concentraciones. Es una herramienta indispensable en los laboratorios de control de calidad.
¿Qué consideraciones deben tomarse en cuenta antes de realizar una cromatografía líquida?
-Es crucial seleccionar adecuadamente la fase móvil, la columna cromatográfica, el volumen de inyección, la temperatura de trabajo, el flujo, y la longitud de onda para obtener resultados precisos en la cromatografía líquida.
Outlines
🧑🏫 Introducción al equipo de HPLC y su funcionamiento
En este párrafo, Lucía Guardiola, profesora de la Universidad Católica de Murcia, introduce el concepto de un equipo de HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Explica que este equipo se utiliza para identificar, cuantificar y purificar componentes en muestras complejas, utilizando un sistema de cromatografía en fase reversa. Describe cómo se mezclan agua y un modificador orgánico (acetonitrilo o metanol) para hacer pasar una muestra a través de una columna cromatográfica, lo que permite separar sus componentes dependiendo de su afinidad con la fase estacionaria (basada en sílice) o la fase móvil. El sistema utiliza una bomba que mantiene un flujo constante y es esencial para el análisis, que finalmente requiere un método de detección adecuado.
🔍 Identificación y detección de compuestos mediante HPLC
Este párrafo detalla cómo, una vez la muestra ha pasado a través de la columna cromatográfica, se emplea un método de detección. El método más común es el detector de diodo array, que utiliza radiación electromagnética para detectar compuestos según su absorción de luz. También se mencionan métodos de fluorescencia, que son más selectivos pero aplicables solo a ciertos compuestos. La elección del detector, la fase móvil y la columna adecuada son esenciales para obtener resultados precisos. Por último, se enfatiza la importancia de elegir la longitud de onda correcta para trabajar en condiciones óptimas.
Mindmap
Keywords
💡HPLC
💡Cromatografía en fase reversa
💡Fase estacionaria
💡Fase móvil
💡Tiempo de retención
💡Detector de diodo array
💡Fluorescencia
💡Pico cromatográfico
💡Estándar
💡Control de calidad
Highlights
Explicación del equipo de HPLC como herramienta para identificar, cuantificar y purificar muestras complejas.
Introducción a la cromatografía en fase reversa, utilizando agua y un modificador orgánico como acetonitrilo o metanol.
Descripción del proceso de inyección de muestras en viales para su análisis.
Explicación de la fase estacionaria en cromatografía líquida y su composición de sílice unida a grupos hidrocarbonados.
Determinación de la afinidad de las muestras hacia la fase estacionaria o móvil, lo que afecta su tiempo de retención.
Importancia de los detectores en cromatografía líquida, mencionando detectores UV-Visible y de diodo array.
Explicación de los métodos de fluorescencia, que permiten determinar analitos específicos.
Descripción del cromatograma resultante, que muestra picos cromatográficos para cada componente detectado.
Proceso de correlación entre áreas de picos cromatográficos y concentraciones de compuestos conocidos usando estándares.
Ejemplo de aplicación: determinación de la cantidad de vitamina C en un zumo utilizando un estándar de concentración conocida.
Importancia de seleccionar adecuadamente la fase móvil, columna, volumen de inyección y condiciones de trabajo.
Aplicaciones de la HPLC en la industria agroalimentaria para detectar micotoxinas en bajas concentraciones.
Determinación de proteínas, vitaminas, aditivos y plaguicidas con alta sensibilidad mediante HPLC.
Importancia del equipo de HPLC en la industria farmacéutica para la determinación de antibióticos y otros compuestos.
Relevancia de la cromatografía líquida como una herramienta indispensable en laboratorios de control de calidad.
Transcripts
hola soy lucía guardiola soy profesora
de la universidad católica de murcia voy
a explicar cómo funciona un equipo de
hpc
un equipo de hp lc es un equipo que
sirve para identificar cuantificar y
purificar muestras complejas en sus
distintos componentes imaginemos que
tenemos una mezcla formada por varios
componentes y queremos identificar por
qué componentes está formado lo que
haremos será seleccionar en este caso
trabajamos con la cromatografía en fase
reversa en fase reversa se trabaja con
agua y un modificador orgánico que suele
ser acetonitrilo y metanol mediante una
bomba que suministra un caudal fijo
constante y esto es muy importante
puesto que trabajaremos ahora lo
comentaré con tiempos de retención
suministra un caudal constante este
caudal constante permite a través de
estos conectores pasar ese modificador
orgánico y el agua a través de todo el
sistema llegamos aquí donde vamos a
colocar nuestra muestra en un vial
colocaremos la muestra que queremos
identificar en un vial
y
realizaremos la inyección
qué es lo que va a ocurrir lo que va a
ocurrir
es que esta agua y este contenido de
esta muestra van a pasar a través de una
columna cromatográfica en esta columna
formato gráfica que es una columna de
acero su interior está formado por
sílice unida a grupos hidrocarbonados
esto es lo que se llama en cromatografía
líquida fase estacionaria lo que ocurre
aquí es que nuestra muestra con el agua
un modificador orgánico va a pasar a
través de esta fase estacionaria y se va
a producir un reparto un reparto entre
la muestra se va a quedar retenida o
bien en la fase estacionaria o bien en
la fase móvil que es lo que haremos
iremos pasando los distintos componentes
y si la muestras más afín al contenido
de la fase estacionaria que dará más
tiempo retenida en su interior y si la
muestra es más afín a lo que hay en la
fase móvil pasará rápidamente a través
de la fase estacionaria una vez que ha
pasado por completo a través de la fase
estacionaria
necesitamos un método de detección el
método de detección es variable en
cromatografía líquida lo que
aprovechamos es una propiedad física
algo que podamos que nos permita
detectar esa propiedad física suele ser
una propiedad física del compuesto o
bien de la fase móvil en este caso vamos
a trabajar con un detector de dio la rai
el diodo array lo que permite es pasar
una radiación electromagnética a través
de esa muestra y lo que vamos a observar
es que los compuestos de interés van a
absorber parte de esa radiación
electromagnética por tanto necesitamos
previamente para trabajar en
cromatografía líquida necesitamos
seleccionar bien las condiciones de
trabajo necesitamos saber qué fase móvil
vamos a utilizar si es agua sola o es
agua + metanol agua metanol acetonitrilo
necesitamos saber qué tipo de columna
vamos a emplear porque las columnas
varían en función de los componentes que
queramos analizar y por último el
detector el detector la mayoría de los
métodos en cromatografía líquida
utilizan un detector ultravioleta
visible o diodo array pero también
podemos aprovechar la propiedad de
algunos compuestos de ser fluorescentes
esta fluorescencia hace que podamos
determinar determinados analitos que
absorben una longitud de onda de
excitación y la emiten a una longitud de
onda llamada longitud de onda de emisión
estos métodos de fluorescencia son mucho
más selectivos que los métodos de diodo
array pero no lamentablemente no todos
los compuestos presentan fluorescencia
podemos realizar alguna modificación en
el compuesto que queramos determinar
para inducirlo a esa fluorescencia pero
en algunos casos podemos utilizar un
diodo array que es un detector universal
- selectivo pero si seleccionamos
adecuadamente la longitud de onda
podemos trabajar adecuadamente en
perfectas condiciones por último cuando
la muestra ha pasado a través del
director lo que observamos finalmente es
un cromatógrafo este es un un
cromatógrafo típico de h plc que es lo
que vamos a observar aquí aquí tenemos
de forma
ampliada todos los componentes que
contiene esta muestra que somos capaces
de detectar bajo esta longitud de onda
280 nanómetros que hemos seleccionado
por tanto podemos determinar pues aquí
vemos cuatro picos cromatográficos que
se llaman que es lo que a priori vemos
aquí pues vemos que aparece un compuesto
que ha tardado en salir a lo largo de
todo el circuito y al atravesar la
columna cromatográfica 7,7 minutos
después tenemos a posteriori a 16
minutos a 17 a 18 y a 20
en principio no podemos saber de qué
componentes estamos hablando pero si
previamente nosotros hemos trabajado con
un estándar un compuesto puro de aquello
que queremos determinar y hemos
trabajado en la concentración
determinada conocida podremos ser
capaces de correlacionar el área que nos
da un pico conocido con el área de
nuestra muestra de interés por ejemplo
queremos saber el contenido en vitamina
c que tiene un zumo lo que vamos a hacer
es preparar una extracción adecuada para
que en nuestro vial que de nuestro zumo
es lo más puro posible que quede
vitamina c y algo más quizá impurezas
pero lo más puro posible eso es
importante seleccionar un método de
extracción adecuado para ello
utilizaremos pues métodos que hay en
bibliografía en internet hay muchísima
información hoy en día al respecto
bueno pues una vez que hemos extraído
adecuadamente la muestra vamos a
seleccionar como he dicho antes la fase
móvil la adecuada la columna con la que
vamos a trabajar
el volumen de inyección que vamos a
inyectar la temperatura a la que vamos a
trabajar el flujo de trabajo y las
condiciones de longitud de onda exactas
a los que vamos a trabajar vale lo
primero que hacemos es inyectar una
cantidad conocida de vitamina c por
ejemplo 1000 ppm sabemos que en nuestro
estándar tiene una concentración de 1000
ppm lo vamos a inyectar y nos da una
área de pico cromatográfico de mil pues
correcta de calibrado o por correlación
directa podemos establecer qué
una área de un pico que salga
exactamente al mismo tiempo que el
patrón de estándar de vitamina c
con un área la que nos salga podremos
correlacionar la concentración que tiene
nuestra muestra de interés con la
concentración del estándar que nosotros
hemos inyectado
las aplicaciones de la cromatografía
líquida son innumerables hoy en día es
una herramienta de trabajo indispensable
para cualquier laboratorio de control de
calidad de una empresa agroalimentaria
nos permite detectar micotoxinas que son
compuestos prohibidos en bajo
concentraciones muy muy pequeñas y este
equipo pero nos permite sensibilidades
muy altas
que más componentes podemos determinar
proteínas podemos determinar vitaminas
del grupo de vitamina c podemos
determinar aditivos ciclamato o ácidos
escobar benzoato que son innumerables
plaguicidas la sensibilidad que ofrece
este equipo para la determinación de
plaguicidas también es importante
antibióticos en la empresa en la
industria farmacéutica es una
herramienta de trabajo también
indispensable es un aparato muy versátil
y aunque requiere un entrenamiento
previo importante y conocer bien la
naturaleza del analito que vamos a
determinar nos ayuda mucho que hay mucha
bibliografía al respecto
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