Cromatografía de líquidos de alta eficiencia

Summary

La cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) es una técnica analítica avanzada utilizada para separar, identificar y cuantificar compuestos en una mezcla. Desarrollada a principios del siglo XX, es clave en bioquímica, química analítica e industrias como la farmacéutica. El proceso incluye el uso de una fase móvil (disolventes), bombas para generar alta presión, un sistema de inyección preciso, columnas cromatográficas y diversos detectores, como el índice de refracción y el espectrómetro de masas. HPLC es ideal para analizar una amplia variedad de sustancias, desde proteínas hasta pesticidas, siendo versátil, rápida y sensible.

Takeaways

• 😀 La cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC) fue desarrollada en 1903 y se utiliza principalmente en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos en una mezcla.
• 😀 HPLC se utiliza en diversas industrias, incluyendo la farmacéutica, para analizar compuestos que no son volátiles, como proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos y plaguicidas.
• 😀 El equipo de HPLC incluye componentes esenciales como reservorios de fase móvil, bombas, sistema de inyección, columnas cromatográficas, detectores y un sistema de registro de datos (computadora).
• 😀 Los reservorios de fase móvil contienen disolventes orgánicos de alta pureza como acetonitrilo, metanol y acetona, y deben ser purgados para eliminar el aire disuelto.
• 😀 Las bombas generan alta presión (de 1 a 600 bares) para permitir que la muestra pase a través de las columnas cromatográficas.
• 😀 El sistema de inyección puede ser manual o automático, utilizando jeringas o válvulas de inyección (loops), para introducir cantidades precisas de muestra en la columna.
• 😀 Las columnas cromatográficas, ubicadas dentro de un horno que puede alcanzar hasta 40°C, contienen una fase estacionaria, generalmente sílice, y se utilizan para separar los compuestos de acuerdo a su relación masa/carga.
• 😀 Existen diferentes tipos de columnas para fases normal y reversa, y se recomienda el uso de una precolumna para proteger la fase estacionaria de contaminantes.
• 😀 Los detectores en HPLC incluyen el detector de índice de refracción, fluorescencia, arreglo de fotodiodos (UV/visible) y espectrómetro de masas, cada uno adecuado para diferentes tipos de análisis.
• 😀 El proceso de inyección y separación de la muestra es gestionado por un programa específico (MaxLink v4.1), que permite configurar disolventes, temperatura, y tipo de análisis (modo isocrático o gradiente).

Q & A

¿Qué es la cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC)?

La cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC) es una técnica analítica utilizada para separar, identificar y cuantificar compuestos de una mezcla utilizando una fase móvil líquida y una alta presión. Fue desarrollada alrededor de 1903 y se aplica principalmente en bioquímica y química analítica.

¿Cuáles son las principales aplicaciones de la cromatografía de líquidos de alta eficiencia?

Las aplicaciones de HPLC incluyen la determinación de aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, esteroides, drogas, plaguicidas, antibióticos, especies metálicas y ciertas sustancias inorgánicas.

¿Qué diferencia a HPLC de la cromatografía de gases?

La principal diferencia es que HPLC se utiliza para analizar muestras no volátiles, que no necesitan ser vaporizadas, mientras que la cromatografía de gases requiere que las muestras sean volátiles.

¿Cuáles son los componentes principales de un sistema HPLC?

Un sistema HPLC consta de reservorios para la fase móvil, bombas para generar presión, un sistema de inyección para introducir las muestras, una columna cromatográfica donde ocurre la separación, detectores para identificar los compuestos separados, y un registrador de datos (computadora) para analizar los resultados.

¿Qué función tienen las bombas en un sistema HPLC?

Las bombas generan la alta presión necesaria para que el líquido o la muestra pase a través de las columnas cromatográficas. La presión puede variar entre 1 y 600 bares.

¿Cómo se realiza la inyección de las muestras en un sistema HPLC?

La inyección de las muestras puede ser manual, usando una jeringa, o automática mediante un sistema de válvulas de inyección. Dependiendo del equipo, se pueden inyectar volúmenes de 5 microlitros hasta 5000 microlitros.

¿Qué es la fase estacionaria en un sistema HPLC y cómo se utiliza?

La fase estacionaria es el material dentro de la columna cromatográfica que interactúa con los compuestos de la muestra, permitiendo su separación. Comúnmente, se utilizan partículas de sílice o carbón activado con tamaños de entre 15 micrómetros.

¿Cuáles son los tipos de columnas utilizadas en HPLC?

Existen columnas para fase normal y para fase reversa. Las columnas de fase reversa, que son las más comunes, suelen tener cadenas de C18, C8, o C12, mientras que las de fase normal son menos usadas debido a su interacción diferente con la muestra.

¿Cómo funcionan los detectores en HPLC?

Los detectores en HPLC miden la cantidad de un compuesto a medida que sale de la columna. Los tipos comunes incluyen el detector de índice de refracción (para compuestos sin UV), el detector de fluorescencia (para compuestos fluorescentes), el detector de fotodiodo (para compuestos absorbentes de UV/Vis), y el espectrómetro de masas (para obtener información detallada de la estructura molecular).

¿En qué consisten los modos isocrático y gradiente en HPLC?

En el modo isocrático, la fase móvil mantiene una composición constante durante todo el análisis. En el modo gradiente, la composición de la fase móvil varía a lo largo del tiempo, lo que permite una mejor separación de compuestos con diferentes propiedades de interacción.