Video 3: Extracción de RNA, transcripción reversa y qPCR

División de Investigación Facultad de Medicina-UNAM

5 Dec 202006:52

Summary

TLDREl script del video presenta un tour por el laboratorio de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes, perteneciente a la Facultad de Medicina de la UNAM. Se describen técnicas como la extracción de RNA, la transcripción reversa y la PCR en tiempo real, fundamentales para la cuantificación y análisis de la expresión génica. El proceso detalla los pasos para la purificación de RNA, la síntesis de cDNA y la medición de la concentración y pureza de la muestra, culminando en el análisis de expresión relativa de los genes, lo que es esencial en la investigación de enfermedades.

Takeaways

🧪 El laboratorio mencionado es parte de la Unidad Periférica de la Facultad de Medicina de la UNAM y está ubicado en el Hospital Infantil de México Federico Gómez.
🔬 Los videos del laboratorio enseñarán técnicas de biología molecular y cultivo celular.
🧴 La extracción de ARN es una técnica clave en el laboratorio, que implica la separación del ARN del ADN para análisis posterior.
❄️ Es crucial mantener las muestras en hielo durante la extracción para prevenir la degradación del ARN.
🔮 Se utiliza un buffer específico para homogeneizar y procesar la muestra de ARN.
🌀 La columna de filtración es una herramienta clave en la purificación del ARN, requiriendo activación y lavado posterior.
💧 Se añaden diferentes volúmenes de isopropanol y buffers de lavado para purificar el ARN.
🔬 La centrifugación es un paso importante para separar componentes y purificar el ARN.
📏 La medición de la absorbancia a 260 y 280 nanómetros permite cuantificar la concentración y pureza del ARN.
🔄 La transcripción reversa es el proceso de síntesis de ADN a partir del ARN, utilizando un conjunto de reactivos específicos.
🔬 La PCR en tiempo real es una técnica utilizada para cuantificar indirectamente la cantidad de ARN mensajero o de transcripción.
📊 El análisis de cétésis (CT) es esencial para calcular la expresión relativa de los genes, comparándolos con un gen control.

Q & A

¿Qué laboratorio se presenta en el video?
-El laboratorio presentado es el de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes, parte de la unidad periférica de la facultad de medicina de la UNAM en el Hospital Infantil de México Federico Gómez.
¿Qué técnicas se muestran en los videos del laboratorio?
-Se muestran técnicas de biología molecular y cultivo celular, incluyendo la extracción de ARN, la transcripción reversa y la PCR en tiempo real.
¿Cuál es el propósito de la extracción de ARN (errónea)?
-La extracción de ARN se realiza para separarlo del ADN con el fin de cuantificarlo, manipularlo o realizar el análisis de la expresión génica.
¿Qué es importante tener en cuenta durante la extracción de ARN?
-Es importante mantener las muestras en hielo durante todo el proceso para evitar la degradación del ARN.
¿Cómo se activa una columna para la extracción de ARN?
-La activación de la columna se hace añadiendo 100 microlitros del buffer de activación a la columna y centrifugándola a 10,000 g por 30 segundos.
¿Cuántos lavados se realizan durante el proceso de extracción de ARN y qué se hace en cada uno?
-Se realizan dos lavados. En el primer lavado se añaden 700 microlitros del buffer de lavado y se centrifuga. En el segundo lavado se repiten los pasos pero con 700 mililitros del buffer de segundo lavado.
¿Cómo se procede a secar la columna después de los lavados?
-Se deja secar la columna centrifugándola nuevamente a 10,000 g por 2 minutos.
¿Qué se añade al ARN para el proceso de ilusión y cuánto tiempo se incuba?
-Se añaden 30 a 50 microlitros de agua o buffer de ilusión al centro de la columna que contiene la erróneas y se incuba durante un minuto a temperatura ambiente.
¿Cómo se cuantifica la concentración y pureza del ARN?
-Se mide la absorbancia a 260 y 280 nanómetros para cuantificar la concentración y pureza del ARN.
¿Qué es la transcripción reversa y qué se necesita para realizarla?
-La transcripción reversa es la síntesis de cDNA a partir del ARN. Se necesita agua libre de nucleasas, buffer, dNTPs, inhibidor de RNasa, mezcla de NTP y la enzima transcriptasa reversa.
¿Para qué se usa la PCR en tiempo real y cómo se realiza?
-La PCR en tiempo real se usa para cuantificar indirectamente la cantidad de ARN mensajero o de transmet. Se realiza mezclando buffer, dNTPs, agua libre de masas, sondas fluorescentes específicas y la cDNA, y se lleva a cabo en un termociclador con las condiciones adecuadas.

Outlines

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🔬 Procedimientos de laboratorio en enfermedades metabólicas

El primer párrafo introduce al laboratorio de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes, que es parte de la unidad periférica de la Facultad de Medicina de la UNAM. Se describen técnicas de biología molecular y cultivo celular, destacando la extracción de ARN erróneo, su cuantificación y manipulación para análisis de expresión génica. Se mencionan los pasos detallados para la extracción, desde la homogeneización con buffer hasta la centrifugación y el lavado de la columna, y finalmente la elución del ARN. También se incluye la medición de la concentración y pureza del ARN a través de la absorción a 260 y 280 nanómetros, y se indica cómo se debe almacenar el ARN.

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🧬 Análisis de expresión génica mediante RT-PCR en tiempo real

El segundo párrafo se centra en la síntesis deARN a partir del ARN erróneo mediante la transcripción reversa, detallando los reactivos necesarios y el proceso de mezcla y homogeneización. Se describe el proceso de PCR en tiempo real para la cuantificación indirecta de ARN mensajero, incluyendo los componentes de la mezcla de reacción y la importancia de las sondas fluorescentes específicas y del gen control. Se menciona la optimización de la cantidad de ARN y la realización de la reacción por triplicado. Finalmente, se aborda el análisis de datos para calcular la expresión relativa de los genes utilizando el método delta del t act.

Mindmap

Keywords

💡Metabólicas

Metabólicas se refiere a las enfermedades relacionadas con los procesos metabólicos del cuerpo, como la obesidad y el diabetes. En el video, este término está asociado con el laboratorio que estudia estas enfermedades, destacando su importancia en la investigación médica.

💡Biología Molecular

La biología molecular es el estudio de los procesos biológicos a nivel molecular, incluyendo la estructura, la función y la interacción de las moléculas que componen las células vivas. En el video, se menciona que se utilizan técnicas de biología molecular para investigar enfermedades como la obesidad y el diabetes.

💡Cultivo Celular

El cultivo celular es el proceso de crecer y mantener células en un medio artificial fuera del organismo. Es una técnica clave en el laboratorio para estudiar las propiedades y comportamientos de las células relacionadas con enfermedades metabólicas.

💡Extracción de ARN

La extracción de ARN es el proceso de separar el ácido ribonucleico (ARN) de las células para su análisis. En el video, se describe cómo se realiza esta técnica para cuantificar, manipular y analizar la expresión génica.

💡Transcripción Reversa

La transcripción reversa es un proceso en el que el ARN mensajero se convierte en ADN a través de la acción de la enzima transcriptasa reversa. Es una técnica utilizada en el laboratorio para la síntesis de ADN a partir de ARN, que es crucial para la detección y cuantificación de genes específicos.

💡PCR en Tiempo Real

La PCR en tiempo real, o RT-qPCR, es una técnica que permite la cuantificación indirecta de ARN a través de la medición de la cantidad de producto de amplificación durante la reacción de PCR. Se menciona en el video como una herramienta para medir la expresión de genes en relación con enfermedades como el diabetes y la obesidad.

💡Absortiometría

La absortiometría es el uso de la absorción de luz para determinar la concentración de una sustancia en una solución. En el contexto del video, se utiliza para medir la absorbancia del ARN a 260 y 280 nanómetros, lo que permite cuantificar la concentración y pureza del ARN extraído.

💡Buffer

Un buffer es una solución que resistencia a cambios en su pH cuando se añade ácido o base. En el video, se mencionan varios buffers, como el buffer del ISISSY y el buffer de lavado, que son esenciales para mantener las condiciones óptimas durante las técnicas moleculares.

💡Termociclador

Un termociclador es un aparato que realiza ciclos de temperatura en reacciones biológicas, como la PCR. En el video, se describe cómo se programa el termociclador para realizar la transcripción reversa y la PCR en tiempo real.

💡Expresión Relativa de Gen

La expresión relativa de un gen se refiere a la cantidad relativa de ARN transcrito de un gen en comparación con un gen control. Es una medida importante en el análisis de la expresión génica, y en el video se describe cómo se calcula a través del método del delta del t act.

Highlights

El laboratorio de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes forma parte de la Unidad Periférica de la Facultad de Medicina de la UNAM.

Se muestran técnicas de biología molecular y cultivo celular utilizadas en el laboratorio.

La extracción de RNA implica la separación de RNA del ADN para su cuantificación y análisis de expresión génica.

Es crucial mantener las muestras en hielo para evitar la degradación de la RNA durante el proceso de extracción.

Se utiliza un buffer del ISISSY para homogeneizar la muestra y separar la RNA.

La columna se activa con un buffer específico y se centrifuga para prepararla para la extracción.

Se añaden 360 microlitros de isopropanol a la muestra para el proceso de filtrado.

Dos lavados se realizan con buffers de lavado para purificar la RNA extraída.

La columna se seca离心ugando a 10,000 g por 2 minutos para eliminar el resto de líquido.

La RNA se eluye con agua o buffer para su uso en futuras reacciones.

La concentración y pureza de la RNA se miden a través de la absorción a 260 y 280 nanómetros.

La transcripción reversa es la síntesis de cDNA a partir de la RNA extraída.

Se mezclan reactivos para la transcripción reversa, incluyendo agua libre de nucleasas, buffer, dNTPs y la enzima transcriptasa reversa.

1000 nanogramos de RNA se añaden por reacción para la síntesis de cDNA.

El termociclador se programa con condiciones específicas para realizar la transcripción reversa.

La PCR en tiempo real se utiliza para cuantificar indirectamente la cantidad de ARN mensajero o ARN transitorio.

La mezcla para la PCR en tiempo real incluye buffer, dNTPs, DNA polimerasa y una sonda fluorescente específica.

Es importante incluir una onda fluorescente para un gen control en la PCR en tiempo real.

La cantidad de cDNA se optimiza para cada muestra en la PCR en tiempo real.

La PCR en tiempo real se realiza en el termociclador con condiciones de incubación específicas.

El análisis de cíclos de denaturación se hace para calcular la expresión relativa de los genes.

La expresión relativa se calcula según el método del delta del t act para la cuantificación de la expresión de un gen.