Práctica 4

Summary

En esta práctica sobre técnicas moleculares enfocadas en proteínas, se explica cómo se producen los anticuerpos policlonales y monoclonales, sus diferencias y aplicaciones en biología molecular. También se detallan métodos de detección de proteínas como el Western Blot, ELISA e inmunohistoquímica, cada uno con sus procesos y utilidades específicas para analizar proteínas de interés. Se mencionan las técnicas de extracción, separación y detección de proteínas, enfatizando su importancia para la investigación en el laboratorio, especialmente en estudios relacionados con enfermedades como el VIH y el daño hepático en ratas.

Takeaways

• 🧬 En la práctica se verán técnicas moleculares enfocadas en proteínas, como la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales.
• 🐰 Los anticuerpos policlonales se producen generalmente en conejos, y detectan múltiples epítopos del antígeno inyectado.
• 🐭 Los anticuerpos monoclonales, más específicos pero menos sensibles, se producen en ratones mediante un proceso más complejo.
• 🧪 Los anticuerpos son esenciales en técnicas de biología molecular para detectar proteínas, como el Western Blot.
• ⚡ El Western Blot separa proteínas por peso molecular utilizando electroforesis y detecta proteínas específicas mediante anticuerpos.
• 🔋 Para que las proteínas migren en la electroforesis, se utiliza SDS, un detergente que cubre las proteínas con cargas negativas.
• 📊 La electrotransferencia permite mover las proteínas a una membrana más resistente, como PVDF, para ser detectadas.
• 💡 El proceso de revelado en Western Blot usa quimioluminiscencia, permitiendo visualizar las proteínas de interés.
• 🌡️ El ELISA es otra técnica usada para detectar y cuantificar proteínas en una muestra mediante cambios de color observables.
• 🔬 La inmunohistoquímica detecta proteínas en tejidos mediante anticuerpos, y la detección se realiza con un microscopio y un patólogo.

Q & A

¿Cuál es la diferencia entre anticuerpos policlonales y monoclonales?

Los anticuerpos policlonales son producidos por múltiples células B y reconocen diferentes epítopos de un antígeno, lo que les da mayor sensibilidad pero menor especificidad. En cambio, los anticuerpos monoclonales se producen a partir de una sola célula B y reconocen un único epítopo, lo que los hace más específicos pero menos sensibles.

¿Cómo se producen los anticuerpos policlonales?

Los anticuerpos policlonales se producen inyectando un antígeno en un animal, como un conejo. Las células B del animal se activan y se dividen, generando células plasmáticas que producen anticuerpos. Luego se toma una muestra de sangre, se separa el suero y se purifican los anticuerpos.

¿Qué es un epítopo?

Un epítopo es una pequeña región del antígeno, generalmente de 8 a 16 aminoácidos, que es reconocida por los anticuerpos.

¿Cuál es el proceso para producir anticuerpos monoclonales?

Para producir anticuerpos monoclonales, se inmuniza un ratón, se aíslan las células B (linfocitos B), se les da estímulo para que sigan produciendo anticuerpos y se purifican de manera independiente. Esto permite obtener anticuerpos dirigidos a un solo epítopo.

¿Qué es la técnica de Western Blot y para qué se utiliza?

La técnica de Western Blot se utiliza para detectar proteínas específicas. Implica la separación de proteínas mediante electroforesis y su transferencia a una membrana resistente. Luego, se detectan usando anticuerpos específicos.

¿Por qué se usa SDS en la electroforesis de proteínas?

SDS es un detergente que cubre las proteínas con cargas negativas, permitiendo que todas migren hacia el polo positivo durante la electroforesis, independientemente de la carga natural de los aminoácidos que las componen.

¿Cuál es la diferencia entre la técnica ELISA y Western Blot?

ELISA es un inmunoensayo cuantitativo que permite detectar proteínas solubles y se basa en la unión de anticuerpos a enzimas. Western Blot, por otro lado, separa proteínas según su peso molecular y permite la detección con anticuerpos, ofreciendo una diferenciación adicional por tamaño.

¿Qué es la inmunohistoquímica y cuál es su finalidad?

La inmunohistoquímica es una técnica que se utiliza para detectar proteínas específicas en tejidos fijados. Consiste en la incubación del tejido con anticuerpos específicos y la detección mediante reacciones que producen un precipitado visible, como la estreptavidina marcada.

¿Cuál es la importancia de la electrotransferencia en la técnica de Western Blot?

La electrotransferencia permite trasladar las proteínas separadas en el gel de electroforesis a una membrana más resistente, donde se realizarán posteriormente las incubaciones con anticuerpos para su detección. Esto facilita la manipulación y el análisis de las proteínas.

¿Cómo se determina la concentración de una muestra en un ensayo ELISA?

En un ensayo ELISA, se utiliza una curva de calibración obtenida con muestras de concentración conocida. Las muestras problema se comparan con esta curva para determinar su concentración basándose en la intensidad de color generada en la reacción.