Western Blotting (WB) - Video Protocol Series

St John's Laboratory Ltd
13 Feb 201608:16

Summary

TLDREn este video, se presenta un protocolo detallado para realizar un Western blot, una técnica fundamental para detectar y cuantificar proteínas específicas en muestras de tejido. Se describe el proceso de separación de proteínas mediante electroforesis en gel y su transferencia a una membrana, así como la incubación con anticuerpos primarios y secundarios para visualizar las proteínas de interés. El video incluye instrucciones precisas sobre la preparación de soluciones, el manejo de equipos y la estimación del peso molecular de las proteínas, lo que permite a los investigadores obtener resultados confiables y reproducibles en sus experimentos.

Takeaways

  • 🔬 La transferencia Western blot permite detectar y cuantificar proteínas específicas en muestras de tejido.
  • 📦 Para preparar la muestra de proteína, combina el tampón de carga, un agente reductor, agua destilada y la muestra de proteína en un tubo.
  • 🔥 Hierve la muestra durante 10 minutos a 80°C para mantener solo la estructura primaria.
  • 💧 Prepara 800 ml de tampón de corrida y añade 500 microlitros de antioxidante para mantener las proteínas en un estado reducido.
  • 🧪 Carga la muestra de proteína y un marcador de proteínas en el gel para visualizar las bandas de peso molecular.
  • ⚡ Conecta los cables a los enchufes de voltaje apropiados y sigue las instrucciones del fabricante para el voltaje y el tiempo de corrida.
  • 🧊 Utiliza el método de transferencia semi-seca para transferir las proteínas del gel a una membrana.
  • 🛑 Aplica un reactivo de bloqueo en la membrana para prevenir la unión de anticuerpos a proteínas no específicas.
  • 🌙 Incuba la membrana con el anticuerpo primario diluido a la temperatura adecuada durante la noche.
  • 🧬 Usa un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante para visualizar la proteína de interés.

Q & A

  • ¿Qué es la técnica de Western blot?

    -La técnica de Western blot se utiliza para detectar y cuantificar proteínas específicas en una muestra de tejido mediante la separación de proteínas por tamaño.

  • ¿Cuáles son los componentes necesarios para preparar la muestra de proteínas?

    -Para preparar la muestra de proteínas, se necesita un buffer de carga, un agente reductor, agua destilada y la muestra de proteína.

  • ¿A qué temperatura se debe hervir la muestra de proteínas y por cuánto tiempo?

    -La muestra de proteínas debe hervirse a 80°C durante 10 minutos para que solo quede la estructura primaria.

  • ¿Qué función tiene el buffer de transferencia en el proceso de Western blot?

    -El buffer de transferencia se utiliza para trasladar las proteínas separadas del gel a una membrana, manteniendo las condiciones adecuadas para preservar las proteínas.

  • ¿Cuál es el propósito de usar un anticuerpo primario en el Western blot?

    -El anticuerpo primario se utiliza para detectar la proteína específica de interés en la membrana, ya que se une a esa proteína.

  • ¿Qué se hace con la membrana después de aplicar el anticuerpo primario?

    -Después de aplicar el anticuerpo primario, la membrana se lava con TBST para eliminar cualquier anticuerpo no unido.

  • ¿Qué es el anticuerpo secundario y cuál es su función?

    -El anticuerpo secundario se utiliza para unirse al anticuerpo primario y facilitar la visualización de la proteína, normalmente está conjugado con una enzima como la peroxidasa.

  • ¿Cómo se visualiza la proteína después de completar el Western blot?

    -La proteína se visualiza al alinear la banda de proteína en la membrana con un marcador de proteínas (ladder), lo que permite estimar su peso molecular.

  • ¿Por qué es importante bloquear la membrana antes de aplicar los anticuerpos?

    -Bloquear la membrana previene la unión de anticuerpos a proteínas no específicas, lo que asegura que la detección sea precisa y específica.

  • ¿Cuánto tiempo se recomienda incubar la membrana con el anticuerpo secundario?

    -Se recomienda incubar la membrana con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora.

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