Western Blotting (WB) - Video Protocol Series

St John's Laboratory Ltd

13 Feb 201608:16

Summary

TLDREn este video, se presenta un protocolo detallado para realizar un Western blot, una técnica fundamental para detectar y cuantificar proteínas específicas en muestras de tejido. Se describe el proceso de separación de proteínas mediante electroforesis en gel y su transferencia a una membrana, así como la incubación con anticuerpos primarios y secundarios para visualizar las proteínas de interés. El video incluye instrucciones precisas sobre la preparación de soluciones, el manejo de equipos y la estimación del peso molecular de las proteínas, lo que permite a los investigadores obtener resultados confiables y reproducibles en sus experimentos.

Takeaways

🔬 La transferencia Western blot permite detectar y cuantificar proteínas específicas en muestras de tejido.
📦 Para preparar la muestra de proteína, combina el tampón de carga, un agente reductor, agua destilada y la muestra de proteína en un tubo.
🔥 Hierve la muestra durante 10 minutos a 80°C para mantener solo la estructura primaria.
💧 Prepara 800 ml de tampón de corrida y añade 500 microlitros de antioxidante para mantener las proteínas en un estado reducido.
🧪 Carga la muestra de proteína y un marcador de proteínas en el gel para visualizar las bandas de peso molecular.
⚡ Conecta los cables a los enchufes de voltaje apropiados y sigue las instrucciones del fabricante para el voltaje y el tiempo de corrida.
🧊 Utiliza el método de transferencia semi-seca para transferir las proteínas del gel a una membrana.
🛑 Aplica un reactivo de bloqueo en la membrana para prevenir la unión de anticuerpos a proteínas no específicas.
🌙 Incuba la membrana con el anticuerpo primario diluido a la temperatura adecuada durante la noche.
🧬 Usa un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante para visualizar la proteína de interés.

Q & A

¿Qué es la técnica de Western blot?
-La técnica de Western blot se utiliza para detectar y cuantificar proteínas específicas en una muestra de tejido mediante la separación de proteínas por tamaño.
¿Cuáles son los componentes necesarios para preparar la muestra de proteínas?
-Para preparar la muestra de proteínas, se necesita un buffer de carga, un agente reductor, agua destilada y la muestra de proteína.
¿A qué temperatura se debe hervir la muestra de proteínas y por cuánto tiempo?
-La muestra de proteínas debe hervirse a 80°C durante 10 minutos para que solo quede la estructura primaria.
¿Qué función tiene el buffer de transferencia en el proceso de Western blot?
-El buffer de transferencia se utiliza para trasladar las proteínas separadas del gel a una membrana, manteniendo las condiciones adecuadas para preservar las proteínas.
¿Cuál es el propósito de usar un anticuerpo primario en el Western blot?
-El anticuerpo primario se utiliza para detectar la proteína específica de interés en la membrana, ya que se une a esa proteína.
¿Qué se hace con la membrana después de aplicar el anticuerpo primario?
-Después de aplicar el anticuerpo primario, la membrana se lava con TBST para eliminar cualquier anticuerpo no unido.
¿Qué es el anticuerpo secundario y cuál es su función?
-El anticuerpo secundario se utiliza para unirse al anticuerpo primario y facilitar la visualización de la proteína, normalmente está conjugado con una enzima como la peroxidasa.
¿Cómo se visualiza la proteína después de completar el Western blot?
-La proteína se visualiza al alinear la banda de proteína en la membrana con un marcador de proteínas (ladder), lo que permite estimar su peso molecular.
¿Por qué es importante bloquear la membrana antes de aplicar los anticuerpos?
-Bloquear la membrana previene la unión de anticuerpos a proteínas no específicas, lo que asegura que la detección sea precisa y específica.
¿Cuánto tiempo se recomienda incubar la membrana con el anticuerpo secundario?
-Se recomienda incubar la membrana con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora.