Video 3: Extracción de RNA, transcripción reversa y qPCR

Summary

El script del video presenta un tour por el laboratorio de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes, perteneciente a la Facultad de Medicina de la UNAM. Se describen técnicas como la extracción de RNA, la transcripción reversa y la PCR en tiempo real, fundamentales para la cuantificación y análisis de la expresión génica. El proceso detalla los pasos para la purificación de RNA, la síntesis de cDNA y la medición de la concentración y pureza de la muestra, culminando en el análisis de expresión relativa de los genes, lo que es esencial en la investigación de enfermedades.

Takeaways

• 🧪 El laboratorio mencionado es parte de la Unidad Periférica de la Facultad de Medicina de la UNAM y está ubicado en el Hospital Infantil de México Federico Gómez.
• 🔬 Los videos del laboratorio enseñarán técnicas de biología molecular y cultivo celular.
• 🧴 La extracción de ARN es una técnica clave en el laboratorio, que implica la separación del ARN del ADN para análisis posterior.
• ❄️ Es crucial mantener las muestras en hielo durante la extracción para prevenir la degradación del ARN.
• 🔮 Se utiliza un buffer específico para homogeneizar y procesar la muestra de ARN.
• 🌀 La columna de filtración es una herramienta clave en la purificación del ARN, requiriendo activación y lavado posterior.
• 💧 Se añaden diferentes volúmenes de isopropanol y buffers de lavado para purificar el ARN.
• 🔬 La centrifugación es un paso importante para separar componentes y purificar el ARN.
• 📏 La medición de la absorbancia a 260 y 280 nanómetros permite cuantificar la concentración y pureza del ARN.
• 🔄 La transcripción reversa es el proceso de síntesis de ADN a partir del ARN, utilizando un conjunto de reactivos específicos.
• 🔬 La PCR en tiempo real es una técnica utilizada para cuantificar indirectamente la cantidad de ARN mensajero o de transcripción.
• 📊 El análisis de cétésis (CT) es esencial para calcular la expresión relativa de los genes, comparándolos con un gen control.

Q & A

¿Qué laboratorio se presenta en el video?

El laboratorio presentado es el de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes, parte de la unidad periférica de la facultad de medicina de la UNAM en el Hospital Infantil de México Federico Gómez.

¿Qué técnicas se muestran en los videos del laboratorio?

Se muestran técnicas de biología molecular y cultivo celular, incluyendo la extracción de ARN, la transcripción reversa y la PCR en tiempo real.

¿Cuál es el propósito de la extracción de ARN (errónea)?

La extracción de ARN se realiza para separarlo del ADN con el fin de cuantificarlo, manipularlo o realizar el análisis de la expresión génica.

¿Qué es importante tener en cuenta durante la extracción de ARN?

Es importante mantener las muestras en hielo durante todo el proceso para evitar la degradación del ARN.

¿Cómo se activa una columna para la extracción de ARN?

La activación de la columna se hace añadiendo 100 microlitros del buffer de activación a la columna y centrifugándola a 10,000 g por 30 segundos.

¿Cuántos lavados se realizan durante el proceso de extracción de ARN y qué se hace en cada uno?

Se realizan dos lavados. En el primer lavado se añaden 700 microlitros del buffer de lavado y se centrifuga. En el segundo lavado se repiten los pasos pero con 700 mililitros del buffer de segundo lavado.

¿Cómo se procede a secar la columna después de los lavados?

Se deja secar la columna centrifugándola nuevamente a 10,000 g por 2 minutos.

¿Qué se añade al ARN para el proceso de ilusión y cuánto tiempo se incuba?

Se añaden 30 a 50 microlitros de agua o buffer de ilusión al centro de la columna que contiene la erróneas y se incuba durante un minuto a temperatura ambiente.

¿Cómo se cuantifica la concentración y pureza del ARN?

Se mide la absorbancia a 260 y 280 nanómetros para cuantificar la concentración y pureza del ARN.

¿Qué es la transcripción reversa y qué se necesita para realizarla?

La transcripción reversa es la síntesis de cDNA a partir del ARN. Se necesita agua libre de nucleasas, buffer, dNTPs, inhibidor de RNasa, mezcla de NTP y la enzima transcriptasa reversa.

¿Para qué se usa la PCR en tiempo real y cómo se realiza?

La PCR en tiempo real se usa para cuantificar indirectamente la cantidad de ARN mensajero o de transmet. Se realiza mezclando buffer, dNTPs, agua libre de masas, sondas fluorescentes específicas y la cDNA, y se lleva a cabo en un termociclador con las condiciones adecuadas.