How to perform colony PCR

Summary

El PCR de colonia es una técnica utilizada para analizar colonias bacterianas y detectar la presencia de un inserto de ADN. En este video se muestra cómo realizar un PCR de colonia rápido y sencillo utilizando el Master Mix DreamT Green de ThermoScientific, que contiene todos los componentes necesarios para la reacción excepto los primers y el ADN. Se prepara una mezcla de PCR, se toma una colonia bacteriana, se resuspende en la mezcla y luego se realiza el PCR seguido de un análisis en gel. Este método simplifica el análisis y ahorra tiempo, ya que no se necesita añadir colorante de carga.

Takeaways

• 😀 El PCR de colonia se utiliza para analizar colonias bacterianas en busca de la presencia de un inserto de ADN tras la clonación.
• 😀 El PCR de colonia es rápido y sencillo usando el DreamT Green PCR Master Mix de Thermo Scientific.
• 😀 El DreamT Green PCR Master Mix contiene todo lo necesario para realizar un PCR, excepto los cebadores específicos y el ADN de plantilla.
• 😀 El Master Mix es de color verde porque incluye reactivos de seguimiento de electroforesis, lo que permite cargar directamente los productos de PCR en un gel.
• 😀 Para preparar el Master Mix, solo se debe agregar agua libre de nucleasas y cebadores específicos de ADN.
• 😀 Es importante preparar suficiente mezcla para todas las reacciones necesarias.
• 😀 Para realizar el PCR de colonia, se debe tomar una colonia bacteriana aislada y transferirla a un plato LB fresco para asegurar la correcta identificación de cada colonia.
• 😀 Después de transferir la colonia a la mezcla de PCR, las células bacterianas se liberan para ser amplificadas en el PCR.
• 😀 El paso inicial de desnaturalización de 5 minutos es crucial para liberar el ADN de las células bacterianas.
• 😀 Los productos de PCR se deben analizar mediante electroforesis en gel. El uso del DreamT Green PCR Master Mix simplifica este proceso, ya que no es necesario agregar colorante adicional al gel.
• 😀 Durante la electroforesis, los dos colorantes del Master Mix se separan, lo que facilita el monitoreo del progreso de la electroforesis.

Q & A

¿Qué es el PCR de colonia y para qué se utiliza?

El PCR de colonia se utiliza para analizar colonias bacterianas y verificar la presencia del ADN insertado después de la clonación.

¿Qué contiene el DreamT Green PCR Master Mix de ThermoScientific?

El DreamT Green PCR Master Mix contiene todo lo necesario para realizar un PCR, excepto los primers específicos para los genes y el ADN plantilla.

¿Por qué el DreamT Green PCR Master Mix es de color verde?

El Master Mix es verde porque incluye dos tintes de electroforesis y un reactivo de densidad, lo que facilita la carga directa de los productos de PCR en los geles después de la amplificación.

¿Qué pasos se deben seguir para preparar la mezcla de PCR de una sola vez?

Para preparar la mezcla de PCR, se debe añadir agua libre de nucleasas y primers específicos para el ADN insertado a la mezcla del DreamT Green PCR Master Mix, y luego distribuir 50 microlitros de la mezcla en cada tubo de PCR.

¿Cómo se realiza la toma de la colonia bacteriana para PCR?

Se utiliza una punta de pipeta estéril para recoger una colonia bien aislada, se transfiere a una placa LB fresca y se etiqueta adecuadamente. Luego, se resuspende la colonia en la mezcla de PCR.

¿Qué ocurre después de resuspender la colonia bacteriana en la mezcla de PCR?

Después de resuspender la colonia en la mezcla de PCR, las células bacterianas se liberan en la mezcla de PCR y luego se transfiere la punta de pipeta a un tubo de cultivo etiquetado para el crecimiento de las células bacterianas.

¿Por qué es importante incluir un paso inicial de desnaturalización de 5 minutos en el PCR?

El paso inicial de desnaturalización de 5 minutos es crucial para liberar el ADN de las células bacterianas en la mezcla de PCR.

¿Cómo se analizan los productos del PCR después de la amplificación?

Los productos de PCR se analizan mediante electroforesis en gel. Se carga entre 5 a 15 microlitros de la mezcla de PCR directamente en un gel.

¿Es necesario agregar colorante adicional al PCR cuando se usa el DreamT Green PCR Master Mix?

No es necesario agregar colorante adicional al PCR, ya que los dos tintes de seguimiento presentes en el DreamT Green PCR Master Mix se separan durante la electroforesis, lo que permite monitorear el progreso de la electroforesis.

¿Cómo se identifican las colonias positivas después de la electroforesis?

Las colonias positivas se identifican observando el patrón de bandas en el gel después de la electroforesis, lo que permite determinar la presencia del ADN insertado.