Bioprocessing Part 1: Fermentation

Summary

El proceso de fermentación, utilizado en la producción de productos lácteos, panificados y bebidas, se describe como una 'descomposición controlada' de alimentos. Se explica cómo las células, como bacterias, hongos o células de mamíferos, son utilizadas en biotecnología para fabricar productos como aminoácidos, biofármacos y vitaminas. El video detalla el ciclo de crecimiento celular y cómo se controla el ambiente en un bioreactor para producir, por ejemplo, la proteina fluorescente verde (GFP), destacando la preparación, la expansión de cepas bacterianas y el monitoreo riguroso del proceso.

Takeaways

• 🍶 La fermentación es un proceso utilizado diariamente para producir una variedad de productos lácteos, productos horneados y bebidas.
• 🌱 Aunque a veces se considera que la fermentación es dejar que los alimentos se deterioren de manera controlada, en realidad es un proceso biológico cuidadosamente regulado.
• 🧫 Se pueden utilizar células de bacterias, hongos o células específicas de mamíferos, plantas o insectos en la biotecnología para producir productos a través de la fermentación.
• 🥛 Para productos lácteos como el yogur, la leche desnatada y el queso, se utilizan bacterias, mientras que para panes y bebidas alcohólicas se usa levadura, un hongo.
• 💊 La fermentación también es fundamental en la producción de algunas vacunas, que requieren la crecimiento de células mamíferas infectadas por un virus específico.
• 🔬 La fermentación es un proceso sencillo que comienza con la selección de una célula capaz de producir el producto deseado y se escala hasta conditions de producción a gran escala.
• 🌡 El proceso de fermentación requiere un control riguroso del entorno en el bioreactor, incluyendo la temperatura, la presión, el pH y los niveles de oxígeno y nutrientes.
• 📈 El crecimiento de las células en la fermentación sigue un patrón predecible con fases de lag, crecimiento exponencial, estacionario y muerte.
• 🌿 Un ejemplo específico mencionado es la producción de la proteina fluorescente verde (GFP), que se usa ampliamente como marcador biológico y no interfiere con las funciones celulares normales.
• 🔬 El proceso de fermentación de la GFP incluye la adición de un antibiótico para proteger la pureza del lote y un inductor bioquímico para activar el gen de la GFP.
• 🔄 La terminación del proceso de fermentación se da cuando el nutriente clave, como el glucógeno, se consume principalmente y el lote alcanza la concentración deseada, listo para pasar a la fase de recuperación.

Q & A

¿Qué es la fermentación y cómo se utiliza en la producción de alimentos y bebidas?

La fermentación es un proceso utilizado diariamente para producir una variedad de productos lácteos, productos horneados y bebidas. Se considera a veces como dejar que los alimentos se deterioren de manera controlada, con la ayuda de microorganismos como bacterias y levaduras.

¿Cuáles son algunos ejemplos de productos que se producen a gran escala mediante la fermentación comercial?

Algunos ejemplos de productos producidos a gran escala incluyen aminoácidos, biofármacos, tintes, enzimas, alimentos, lípidos, esteroides y vitaminas.

¿Cómo se selecciona una célula para la fermentación y qué papel desempeña en el proceso?

Una célula se selecciona según su capacidad para producir el producto deseado. Las células pueden ser bacterias, hongos o células de mamíferos, plantas o insectos. Se utilizan para fabricar un producto en un proceso llamado fermentación en biotecnología.

¿Qué es el medio de cultivo y cómo provee las necesidades nutricionales de las células durante la fermentación?

El medio de cultivo es una sustancia que proporciona las sustancias nutritivas que las células necesitan para crecer. Incluye nutrientes, estabilizadores, antibióticos y agentes antiespumantes, y se mezcla con el agua de alta pureza para preparar el medio antes de la fermentación.

¿Qué es un bioreactor y cómo se utiliza en la fermentación?

Un bioreactor, también conocido como fermentador, es un recipiente donde se lleva a cabo la fermentación a gran escala. Proporciona condiciones controladas para el crecimiento de las células y la producción del producto, con sensores integrados para monitorear factores críticos como temperatura, pH, oxígeno disuelto y presión.

¿Cuáles son las fases del ciclo de vida de una lote de fermentación y cómo se relacionan con la producción del producto?

Las fases incluyen la fase de adaptación (lag), la fase de crecimiento exponencial (log), la fase estacionaria y la fase de muerte. Cada fase es crucial para el rendimiento de la fermentación, ya que la producción del producto se maximiza generalmente durante la fase estacionaria cuando los nutrientes clave se han consumido y la concentración de células es óptima.

¿Qué es la proteína fluorescente verde (GFP) y cómo se produce mediante la fermentación?

La GFP es una sustancia fluorescente ampliamente utilizada como marcador biológico. Se produce a través de la fermentación utilizando bacterias E. coli genéticamente modificadas para producir GFP. Se agrega un inductor bioquímico (IPTG) para activar la expresión del gen de la GFP en las células.

¿Cómo se prepara el área y el equipo antes de iniciar el proceso de fermentación?

El área y el equipo se preparan eliminando material no utilizado, limpiando y sanitizando el área y el equipo, y esterilizando el equipo según los procedimientos operativos estándar (SOPs). También se verifican y calibran los instrumentos y se cargan y verifican los softwares de control de proceso.

¿Qué pasos se siguen para la expansión del lote de semilla bacteriano y la inoculación en el bioreactor?

Primero, se descongela la bacteria E. coli modificada y se inocula en un frasco de agitación con medio fresco. Una vez que las células alcanzan la cantidad objetivo, se preparan para la fermentación. Se verifica y calibra el equipo crítico, se mezcla el medio en el bioreactor, se esteriliza y se inocula con el lote expandido de la semilla bacteriana.

¿Cómo se monitorea y controla el proceso de fermentación durante su ejecución?

Durante la fermentación, se toman lecturas regulares de temperatura, RPM del agitador, niveles de oxígeno disuelto, pH, presión del recipiente, densidad óptica, tasa de flujo de aire y concentraciones de glucosa. Estos datos se grafican y documentan para garantizar que el proceso se realice de manera efectiva.

¿Qué ocurre una vez que se completa la fermentación y cómo se procesa el producto final?

Una vez completa la fermentación, el producto (llamado mosto) se enfríe, se bombea a un tanque de mosto y se etiqueta con el número de lote, volumen, tiempo y fecha. El mosto, que contiene los medios gastados y las células, se traslada al proceso de recuperación, donde se rompen las células para liberar la GFP y se separa de los otros componentes del mosto.

Outlines

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🍶 Introducción a la Fermentación

El primer párrafo introduce el concepto de fermentación como un proceso utilizado extensamente para producir una variedad de productos como lácteos, panificados y bebidas. Aunque a menudo se asocia con la descomposición controlada de alimentos, la fermentación es una poderosa herramienta biotecnológica que puede emplearse para crear una amplia gama de productos biológicos de manera rentable. Se menciona que las células, que pueden ser bacterias, hongos o células de mamíferos, plantas o insectos, actúan como microfabricas para producir una amplia variedad de productos, desde aminoácidos hasta vitaminas. La fermentación es descrita como un proceso sencillo que comienza con la selección de una célula productiva, la cual se cultiva en un medio de cultivo que proporciona los nutrientes necesarios. Este proceso se escala hasta llegar a un bioreactor donde las células crecen y producen el producto deseado. Además, se destaca la importancia de un ambiente controlado y la necesidad de monitorear y controlar factores críticos como temperatura, presión, pH y nivel de oxígeno disuelto.

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🌱 Ciclo de Crecimiento de las Células en la Fermentación

El segundo párrafo se centra en el ciclo de crecimiento de las células durante la fermentación, que incluye cuatro fases: lag (lento), exponencial o logarítmica (rápida), estacionaria y muerte. Se describe cómo las células se adaptan al medio nuevo, aumentan exponencialmente y, eventualmente, entran en la fase estacionaria cuando los nutrientes se agotan y las células comienzan a morir. Si la fermentación continuara, las células entrarían en la fase de muerte donde la tasa de mortalidad supera la tasa de división celular. Este párrafo también establece el escenario para el proceso de fermentación de la proteína fluorescente verde (GFP), un marcador biológico ampliamente utilizado que no interfiere con las funciones celulares normales. Se mencionan los materiales necesarios para este proceso, incluyendo una cepa bacteriana de E. coli genéticamente modificada para producir GFP, un medio de cultivo compatible y un inductor bioquímico llamado IPTG que activa la producción de GFP.

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🔬 Proceso de Producción de Proteína Fluorescente Verde (GFP)

El tercer párrafo detalla el proceso de producción de GFP, comenzando con la expansión de la cepa bacteriana modificada en un frasco agitador con medio de cultivo. Una vez que las células alcanzan la cantidad objetivo, se preparan para la fermentación. Se describe la preparación del área de fermentación, incluyendo la verificación de equipos críticos, la calibración de sondas y la adición de agua de alta pureza al bioreactor. Se mezclan los ingredientes del medio, se esteriliza el bioreactor y se añaden los ingredientes finales, incluyendo la solución de glucosa y la solución de antibióticos. Posteriormente, se inocular la cepa expandida en el bioreactor y se inicia la fermentación, monitoreando constantemente parámetros como temperatura, RPM del agitador, niveles de oxígeno disuelto, pH, presión del recipiente, densidad óptica, tasa de flujo de aire y concentraciones de glucosa. Cuando se alcanzan los niveles objetivo de glucosa y densidad óptica, se agrega IPTG para activar la producción de GFP. Finalmente, se toman lecturas finales, se extrae una muestra para verificar la concentración de sólidos celulares y se termina la fermentación. El 'broth' resultante, que contiene los restos del medio y las células, se enlenta, se bombea a un tanque de 'broth' y se etiqueta con el número de lote, volumen, tiempo y fecha. El proceso de fermentación se completa y el 'broth' recolectado se dirige al proceso de recuperación, donde se liberará la GFP de las células y se separará de los demás componentes del 'broth'.

Keywords

💡Fermentación

La fermentación es un proceso biológico utilizado para producir una amplia variedad de productos como lácteos, panes y bebidas. Se puede considerar como un proceso controlado de 'envenenamiento' de los alimentos. En el vídeo, se menciona que la fermentación es una poderosa herramienta para crear productos biológicos de manera rentable, y se utiliza para transformar leche en yogur, hacer panes y producir alcohol a partir de cereales.

💡Células

Las células, que pueden ser bacterias, hongos o células de mamíferos, plantas o insectos, son consideradas como 'fábricas micros' en la biotecnología. Estas células son utilizadas para producir productos en un proceso de fermentación, como se describe en el vídeo con ejemplos de yogur, pan y vacunas.

💡Biorreactor

Un bioreactor, también conocido como fermentador, es un contenedor donde se lleva a cabo la fermentación a gran escala. En el guion, se describe cómo los bioreactores son equipados con sensores y controles para mantener condiciones controladas, y cómo se utiliza para la producción de GFP (Proteína Fluorescente Verde).

💡Media

La media es una sustancia que proporciona los nutrientes necesarios para el crecimiento de las células en la fermentación. Se menciona en el vídeo que la media se prepara y se esteriliza antes de agregar las células, y que contiene ingredientes como extracto de levadura, caldo de soja triptófico, cloruro de amonio y compuestos antiespumantes.

💡E. coli

Escherichia coli (E. coli) es una bacteria que se utiliza en la producción de GFP. En el vídeo, se describe cómo E. coli ha sido genéticamente modificada para producir GFP y cómo se utiliza para iniciar el proceso de fermentación.

💡GFP (Proteína Fluorescente Verde)

La Proteína Fluorescente Verde (GFP) es un marcador biológico ampliamente utilizado. Se destaca en el vídeo cómo la GFP es producida a través de la fermentación, y se describe el proceso detallado de agregar inductores bioquímicos para activar su producción en las células de E. coli.

💡Ciclo de Crecimiento Celular

El ciclo de crecimiento celular en la fermentación incluye fases como la de adaptación (lag), crecimiento exponencial (log), estación (stationary) y muerte (death). Estas fases son fundamentales para entender cómo se controla y optimiza el proceso de fermentación, como se explica en el vídeo.

💡Control de Proceso

El control de proceso es esencial en la fermentación para garantizar que las condiciones sean óptimas para el crecimiento de las células y la producción del producto. En el guion, se menciona cómo se monitorean y controlan factores como la temperatura, la presión, el pH y los niveles de oxígeno disuelto.

💡Optical Density

La densidad óptica es una medida de la concentración de células en el bioreactor y es un indicador clave del crecimiento celular. En el vídeo, se describe cómo se monitorea la densidad óptica durante la fermentación para determinar cuándo agregar inductores y cuándo finalizar el proceso.

💡Inductor Bioquímico

Un inductor bioquímico es una sustancia que se utiliza para activar la producción de un producto específico en las células. En el contexto del vídeo, IPTG es un inductor que se agrega para activar la producción de GFP en las células de E. coli.

Highlights

Fermentación es un proceso utilizado diariamente para crear una variedad de productos lácteos, panificados y bebidas.

La fermentación transforma la leche en yogur, hace que el pan se levante y los granos se descompongan para crear bebidas alcohólicas y combustibles alternativos.

Las células utilizadas en biotecnología para la fermentación pueden ser bacterias, hongos o células específicas de mamíferos, plantas o insectos.

La fermentación es un proceso sencillo que comienza con la selección de una célula capaz de producir el producto deseado.

El medio de cultivo proporciona los nutrientes necesarios para el crecimiento celular y la producción del producto.

La fermentación se escala gradualmente, aumentando la cantidad de medio y las células hasta llegar a un bioreactor.

El proceso de fermentación es un paso inicial en la producción antes de la recuperación, purificación, formulación, llenado y empaquetado.

Las células tienen diferentes necesidades, como la necesidad de oxígeno, la cual se ajusta en el medio de cultivo.

El control riguroso del entorno dentro del bioreactor es esencial para una fermentación eficiente, incluyendo la temperatura, la presión y el pH.

El ciclo de crecimiento celular en la fermentación sigue una secuencia predecible: fase de lag, crecimiento exponencial, estación y muerte.

La producción de GFP (Proteina Fluorescente Verde) es un ejemplo de cómo se lleva a cabo un proceso de fermentación específico.

Para la producción de GFP, se utilizan bacterias E. coli genéticamente modificadas y un medio de cultivo compatible.

El bioreactor es equipado con un manto de agua para regular la temperatura y sensores integrados para monitorear factores ambientales clave.

La preparación del área incluye la eliminación de equipos y materiales no utilizados, la limpieza y la esterilización de los equipos.

El proceso de fermentación comienza con la expansión de la cepa bacteriana en un frasco agitador.

El medio de cultivo se mezcla en el bioreactor, se esteriliza y se preparan para la inoculación con la cepa bacteriana expandida.

Durante la fermentación, se monitorean parámetros críticos como la temperatura, la velocidad del agitador, los niveles de oxígeno disuelto, el pH y la concentración de glucosa.

Se agrega IPTG al bioreactor para activar la producción de GFP, y se toman lecturas finales antes de que el proceso de fermentación se complete.

Una vez que la fermentación está completa, el caldo fermentado se enfriará, se bombeará a un tanque de caldo y se etiquetará para el siguiente proceso de recuperación.

Transcripts

we all know something about fermentation  it's a process used countless times each  

day to make a variety of dairy products baked  goods and beverages we sometimes think of it as  

letting foods go bad but in a controlled way  with a little help milk becomes yogurt bread  

Rises and grains decompose creating alcoholic  beverages and alternative fuels but looking at  

these examples only gives us a clue as to  what's really happening and how we can use  

the power of fermentation to cost-effectively  create a broad array of biological products so  

what is fermentation a cell can be thought of as a  micro Factory these cells can be bacteria fungi or  

specific cells from mammals plants or insects in  biotechnology these cells are used to manufacture  

a product in a process called fermentation for  yogurt butter milk and cheese we use bacteria to  

make breads and alcoholic beverages we use yeast  a fungus and the production of some vaccines  

require the growth of mammalian cells that are  infected with a specific virus the product the  

cells manufacture is usually a chemical the  cells contain naturally or a substance that  

the cells have been genetically altered to  create or even a metabolic waste product of  

the organisms growth like one of our examples  alcohol there are too many everyday products  

created by commercial-scale fermentation  to even list but some common ones include  

amino acids biopharmaceuticals dyes enzymes  food products lipids steroids and vitamins

fermentation is a reasonably simple process a  cell is selected based on its ability to produce  

the desired product a seed stock of cells is put  into a small amount of media media provides the  

nutritional products the cell needs to grow  when the population of cells has grown and  

consumed most of the nutrients it's moved into  a larger vessel with more growth media and the  

process repeats this scaling up is complete when  the quantity of cells is large and healthy enough  

to transfer into a production vessel often  referred to as a bioreactor or fermenter with  

plenty of fresh media now available in under  tightly controlled conditions the cells grow  

and manufacture product when the fermentation is  complete the product is harvested fermentation  

is known as an upstream biotechnology process  it occurs early in the production flow before  

recovery purification formulation filling and  packaging to better understand the fermentation  

process we should first find out a little bit  about the cells we use and what they may require  

to reproduce and stay healthy different cells  have different needs some are aerobic they need  

oxygen while others are anaerobic and do not  require oxygen all cells require nutrition a  

properly formulated media contains the necessary  nutrients to allow cells to grow and produce the  

fermenter mixes the cells evenly throughout the  media to suspend the cells and supply the oxygen  

necessary for growth effective and efficient  fermentation requires rigorous monitoring and  

control of the environment within the bioreactor  key factors include temperature pressure pH which  

is a measure of how acidic or alkaline the media  is oxygen usually measured as dissolved oxygen  

within the media and nutrient levels although  the environment and the media are tailored to  

the needs of specific cells the lifecycle of  almost all batches follows a predictable pattern  

the growth pattern has four phases lag exponential  or log stationary and death when a cell is first  

introduced to fresh media it has to adapt to its  new environment this creates a lull or lag in the  

growth timeline after the organism adapts the  batch takes off the cells begin dividing at a  

constant rate an exponential or logarithmic or log  increase doubling then doubling again and on and  

on as the nutrients in the media are consumed  toxic metabolic waste products build-up cells  

begin to die and growth slows when it reaches the  point that just as many cells are dying as our  

dividing the batch enters the stationary phase  this is the point at which the key nutrients  

are completely consumed the fermentation is  stopped and the fermented broth is harvested if  

the fermentation were allowed to continue the  cells would enter the death phase more cells  

die than divided and similar to the exponential  phase the death rate increases logarithmically

now that we have a basic understanding of how  fermentation works let's look at an actual  

process and see how it all comes together for our  sample process we will look at the production of  

green fluorescent protein or GFP GFP is broadly  used as a biological marker it's a fluorescent  

dye that's very well tolerated by most cells and  doesn't interfere with normal cellular function in  

the GFP fermentation process we'll need to add an  antibiotic to protect the purity of the batch and  

then late in the process a biochemical inducer  to turn on the GFP gene our materials for this  

process will include a bacterial seed stock  in this case e coli that has been genetically  

enhanced to produce GFP the basic ingredients  for a compatible media which include nutrients  

stabilizers and antibiotic and an anti foaming  agent and iptg which is the biochemical inducer  

that switches on the GFP gene the equipment that  we'll be using includes a 300 liter bioreactor a  

uv-vis spectrophotometer to monitor the optical  density which is a measure of the concentration  

of cells in the bioreactor a glucose analyzer  to measure glucose a key nutrient an offline  

pH meter to help track the acid-base balance  and adjust online measurements if needed and  

a broth tank for our final product the bioreactor  is equipped with a water jacket around the vessel  

to regulate temperature and integrated sensors  to monitor key environmental factors including  

dissolved oxygen pH internal temperature  water jacket temperature and vessel pressure  

the reactor also has an agitator dedicated ports  for adding seed stock and media ingredients  

separate ports for acid and base supplement  air filters for supply and exhaust and valves  

for drawing samples and for harvesting most  fermentation and monitoring functions can be  

managed from the bioreactors dedicated process  controller before the fermentation process can  

begin the area must be prepared preparation  includes removing equipment and material  

that won't be used in the process cleaning  and sanitizing the area and equipment and  

sterilizing equipment as required by the SOPs  standard operating procedures sterilization is  

used to eliminate unwanted microorganisms which  can grow naturally in the fermentation media and  

process equipment also all required materials and  documentation should be gathered and prepared and  

all process control software should be loaded  and verified the fermentation batch process  

will be guided and documented with the BPR batch  process record the batch record leads the operator  

through the process step by step with each step  requiring a sign-off and seperate verification

this record also includes spaces for documenting  key times activities and instrument readings  

the GFP fermentation process really begins with  the expansion of our bacterial seed stock after  

removing the specially modified ecoli from the  freezer and thawing it it's used to inoculate  

a small amount of fresh media in a shaker  flask after the number of cells has reached  

the target amount the thriving cells are ready  for fermentation meanwhile in the fermentation  

area operators begin with a complete check of  all critical equipment valves caps and lines are  

checked hoses are tightened probes are verified  and calibrated and 10 kilograms of hpw high purity  

water is added to the vessel the bioreactor is  brought up to normal process pressure and held  

there in order to check for leaks the pressure  is monitored over a 30 minute period if a leak is  

detected the problem is corrected and the test is  run again once the reactor passes the test we are  

ready to mix the media in the vessel the agitator  is turned on and the ingredients are added

yeast extract tryptic soy broth ammonium  chloride sodium by phosphate monopotassium  

phosphate and an anti foam compound once all  the initial ingredients are in another ten  

kilograms of high purity water is added all  ports and valves are closed all condensate  

valves are open and the bioreactor begins  an SI p sterilize in place cycle the target  

for sterilization is 121 degrees celsius  for 30 minutes as soon as the temperature  

climbs to the targeted temperature the  condensate valves are closed and the SI  

P cycle completes automatically both the vessel  and the media are now sterile and we're ready  

to add the final ingredients to our media  the glucose hose is attached to the vessel  

the connection is steamed to sterilize it and  the separately sterilized glucose antibiotic  

solution is pumped into the vessel then  a manual pH reading of the media is taken

and the bioreactor is set up for its fermentation  cycle after the inoculation hose is connected  

to the reactor and steamed for 20 minutes the  expanded seed stock is pumped into the reactor  

containing the media fermentation now begins the  operator takes zero hour readings and begins to  

regularly monitor batch temperature agitator RPMs  dissolved oxygen levels pH vessel pressure optical  

density air flow rate and glucose concentrations  optical densities and glucose concentrations are  

of particular interest so they're graphed as  well as documented when the targeted levels of  

glucose and optical density are achieved it's  time to add iptg to the vessel to activate or  

turn on the expression of the green fluorescent  protein in the cells after allowing enough time  

for the cells to produce green fluorescent  protein usually 5 hours more final readings  

are taken and a sample is drawn to check the  percentage of cell solids the product is now  

referred to as broth the broth which contains  spent media and cells is complete when the key  

nutrient glucose is mostly consumed and the  batch has reached the desired concentration  

the batch is then cooled down pumped into a  broth tank and labeled with the batch number  

volume time and date the fermentation process  is now complete the harvested broth will now  

move downstream to the recovery process where  the cells will be ruptured to free the green  

fluorescent protein and the protein will be  separated from the other broth components you

you