Procedimientos básicos en cultivos celulares

Summary

Este video describe el proceso de cultivo celular en un laboratorio, desde la revisión inicial bajo el microscopio invertido para verificar la confluencia de las células y la ausencia de contaminantes, hasta la subcultivación de las células y su propagación en placas de cultivo. Se detallan técnicas como el uso de tripsina para separar las células, la centrifugación para concentrarlas y el conteo celular con azul de tripán. Además, se explica cómo realizar pruebas específicas utilizando microscopía de fluorescencia o citometría, con énfasis en mantener condiciones óptimas para el crecimiento celular.

Takeaways

• 😀 Es fundamental limpiar la cámara de trabajo antes de comenzar el cultivo celular y contar con los reactivos necesarios.
• 😀 Se debe revisar el cultivo previo bajo un microscopio invertido para garantizar que no haya contaminación bacteriana o de levaduras.
• 😀 La confluencia celular se alcanza cuando todas las áreas de la superficie plástica están cubiertas por las células, lo cual puede tomar entre 24 a 72 horas, dependiendo de la línea celular.
• 😀 El fenómeno de inhibición por contacto ocurre cuando las células disminuyen su motilidad, lo que indica que se ha alcanzado la saturación del cultivo.
• 😀 El crecimiento celular sigue una curva exponencial, pero al llegar a la fase estacionaria, es necesario realizar un subcultivo para mantener el crecimiento.
• 😀 El medio de cultivo antiguo se debe retirar para eliminar los desechos y células muertas, lo que también incluye la eliminación del exceso de suero fetal bovino.
• 😀 La separación de las células del plástico se realiza mediante la acción de tripsina, la cual debe incubarse a 37°C durante 15 minutos para favorecer la disociación celular.
• 😀 Después de la separación, se debe agregar un medio de cultivo para inactivar la tripsina, ya que en exceso puede resultar tóxica para las células.
• 😀 Las células suspendidas se deben centrifugar para concentrarlas, descartando el sobrenadante y resuspendiendo las células en nuevo medio de cultivo.
• 😀 Para propagar las células, se toma una fracción del cultivo (split) y se transfiere a un nuevo recipiente con más medio, incubando a 37°C durante dos o tres días.
• 😀 Si se necesita realizar un conteo celular, se mezcla una alícuota con azul de tripano y se utiliza una cámara de Neubauer para contar las células vivas y muertas.
• 😀 Dependiendo del tratamiento, los cultivos pueden requerir medios sin indicadores de pH y los tratamientos pueden aplicarse desde el inicio o después de alguna incubación.

Q & A

¿Por qué es importante revisar la cultura celular bajo el microscopio invertido?

Es importante revisar la cultura celular bajo el microscopio invertido para garantizar que no haya contaminación por bacterias o levaduras y confirmar que las células han alcanzado la confluencia deseada.

¿Qué es la confluencia celular y cómo se evalúa?

La confluencia celular se refiere a la cobertura completa de la superficie del cultivo por las células. Se evalúa observando el porcentaje de la superficie cubierta, y cuando las células alcanzan una confluencia total, es cuando se comienza a observar la inhibición por contacto.

¿Qué es la inhibición por contacto y por qué ocurre?

La inhibición por contacto es un fenómeno en el cual las células reducen su motilidad y su capacidad de dividirse cuando han cubierto toda la superficie disponible. Esto ocurre debido a la saturación del espacio y la acumulación de desechos, lo que también reduce la disponibilidad de nutrientes.

¿Cómo se realiza la subcultivo celular y cuándo se debe hacer?

El subcultivo celular se realiza cuando las células alcanzan la fase estacionaria de su crecimiento, justo antes de que comiencen a experimentar inhibición por contacto. En este proceso, las células se separan de la superficie del cultivo y se redistribuyen en nuevos recipientes con medio fresco.

¿Por qué es necesario eliminar el medio de cultivo antiguo antes de realizar el subcultivo?

Es necesario eliminar el medio de cultivo antiguo para remover los desechos, células muertas y el exceso de suero fetal bovino, lo que puede interferir con la acción de los enzimas como la tripsina y afectar la viabilidad celular.

¿Cuál es el propósito de la tripsina en el subcultivo celular?

La tripsina se utiliza para romper las adhesiones entre las células y entre las células y la superficie del recipiente, permitiendo que las células se separen y puedan ser transferidas a nuevos cultivos.

¿Por qué se realiza una centrifugación después de la separación celular?

La centrifugación se realiza para concentrar las células en una pequeña fracción, eliminando el sobrenadante que contiene los residuos y el exceso de medio de cultivo, lo que asegura que solo las células viables queden para ser resuspendidas en un nuevo medio.

¿Qué es la cuenta celular y cómo se realiza?

La cuenta celular es el proceso de determinar el número de células viables en una muestra. Se realiza mezclando una muestra con azul de tripano, un colorante que marca las células muertas, y observando las células bajo el microscopio en una cámara de Neubauer para contar las células vivas y muertas.

¿En qué casos se utilizan placas de cultivo para realizar pruebas celulares?

Las placas de cultivo, como las de 6 o 24 pocillos, se utilizan cuando se requieren realizar pruebas o tratamientos específicos, como aquellos que involucran técnicas de fluorescencia, ya que permiten un manejo controlado de las células y la evaluación de los efectos del tratamiento.

¿Qué factores se deben tener en cuenta al elegir el medio de cultivo para una prueba específica?

Al elegir el medio de cultivo para una prueba específica, se debe considerar si el tratamiento requiere medios sin indicadores de pH, como en el caso de técnicas de fluorescencia, ya que estos pueden interferir con los resultados de la prueba. También es importante decidir si los tratamientos deben aplicarse antes o después de la siembra o incubación.