How to subculture (passage) primary cells

Summary

Este video guía a los usuarios a través del proceso de subcultivo de células primarias. Se destaca la importancia de seguir las instrucciones del manual de productos para cada tipo celular y de preparar correctamente los medios y suplementos. El procedimiento incluye la observación de la confluencia celular, el uso de tripsina y EDTA para disociar las células, y la posterior centrifugación y resuspensión. Finalmente, se explica cómo sembrar las células en nuevos frascos de cultivo para su posterior incubación y experimentación, asegurando así un subcultivo exitoso.

Takeaways

• 😀 Asegúrate de seguir siempre el manual del producto para tu tipo celular específico.
• 😀 Reúne todos los materiales e instrumentos necesarios en una cabina de cultivo celular.
• 😀 Prepara los medios y suplementos de cultivo según las instrucciones del producto y etiqueta todas las botellas de medio.
• 😀 Inspecciona las células bajo el microscopio para asegurarte de que la confluencia sea del 80% y que haya células en mitosis.
• 😀 Elimina el medio de cultivo del frasco antes de añadir la solución de tripsina-EDTA.
• 😀 Agrega 9 mL de solución de tripsina-EDTA, mueve el frasco para cubrir toda la superficie y luego elimina la solución.
• 😀 Añade 3 mL de solución fresca de tripsina-EDTA e incuba a temperatura ambiente hasta que las células se redondeen, lo que puede tardar entre 1 y 20 minutos.
• 😀 Realiza una inspección rápida bajo el microscopio para confirmar que las células se han disociado correctamente.
• 😀 Neutraliza la tripsina agregando 9 mL de solución neutralizadora y transfiere las células a un tubo cónico de 50 mL.
• 😀 Centrifuga las células a 180g durante 7 minutos, luego elimina cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.

Q & A

¿Por qué es importante seguir las instrucciones del manual del producto para cada tipo de célula?

Es crucial seguir las instrucciones específicas del manual para garantizar que las células se mantengan viables y que el proceso de subcultivo sea exitoso. Cada tipo de célula puede requerir condiciones particulares de medios y suplementos.

¿Qué significa 'confluencia del 80%' en el contexto de la cultiva de células?

La confluencia del 80% indica que el 80% de la superficie del vaso de cultivo está cubierta por células adheridas. Es el momento óptimo para subcultivar las células, ya que están lo suficientemente numerosas sin estar completamente abarrotadas.

¿Por qué es necesario usar solución de tripsina-EDTA durante el subcultivo?

La tripsina-EDTA se utiliza para disociar las células adheridas al fondo del vaso de cultivo. La tripsina degrada las proteínas que mantienen las células adheridas, mientras que el EDTA se encarga de eliminar el calcio, lo que facilita la separación de las células.

¿Qué pasos se deben seguir después de añadir la tripsina-EDTA a las células?

Después de añadir la tripsina-EDTA, debes agitar suavemente el frasco para cubrir toda la superficie celular y luego retirarlo. Posteriormente, se añade una segunda cantidad de tripsina-EDTA y se incuba a temperatura ambiente hasta que las células se redondeen y se separen del sustrato.

¿Por qué es importante observar las células bajo el microscopio durante el proceso de disociación?

Observar las células bajo el microscopio permite verificar que la disociación se esté realizando correctamente y que las células se hayan desprendido por completo del fondo del vaso de cultivo sin daño excesivo.

¿Qué debe hacerse si algunas células permanecen adheridas después de la disociación?

Si algunas células permanecen adheridas, puedes golpear suavemente el frasco para dislodarlas. Es importante no aplicar una fuerza excesiva para evitar dañar las células.

¿Por qué se utiliza un neutralizador de tripsina después de la disociación de las células?

El neutralizador de tripsina se utiliza para detener la acción de la tripsina y evitar que siga afectando a las células. Esto es esencial para garantizar que las células no sufran daño durante el proceso.

¿Qué sucede después de centrifugar las células tras agregar el neutralizador?

Después de centrifugar, las células se agrupan en un pellet en el fondo del tubo. El sobrenadante debe ser cuidadosamente retirado sin perturbar el pellet celular, para evitar la pérdida de células.

¿Por qué es importante no aplicar una fuerza de centrifugado excesiva?

Aplicar una fuerza excesiva de centrifugado puede dañar las células, comprometiendo su viabilidad y su capacidad para adherirse y proliferar después del subcultivo.

¿Cómo se determina la concentración de células en la suspensión?

La concentración celular se determina mediante un conteo celular, usualmente con un hemocitómetro o un contador automático, lo que permite ajustar la cantidad de células a sembrar en los nuevos frascos de cultivo.

¿Cuál es el objetivo de sembrar las células en nuevos frascos de cultivo?

Sembrar las células en nuevos frascos a la densidad apropiada permite que las células se adhieran y crezcan en condiciones controladas, facilitando su uso en experimentos posteriores.