Cytek Aurora Training Part 1: Introduction to Full Spectrum Flow Cytometry

Summary

Laura Johnston, directora asociada científica en el Flow Core de la Universidad de Chicago, presenta un curso sobre citometría de flujo espectral utilizando el sistema Aurora. A lo largo de varios videos, explica las diferencias entre la citometría de flujo convencional y la espectral, detallando cómo esta última permite un análisis más preciso de los fluoróforos mediante la captura de espectros completos. Además, proporciona una guía para diseñar paneles, preparar controles de referencia, realizar la tinción de muestras y utilizar el software SpectroFlow para la mezcla espectral, todo mientras destaca la importancia de las condiciones adecuadas de tinción y el manejo de autofluorescencia.

Takeaways

• 😀 Laura Johnston es la directora asociada científica del Flow Core en la Universidad de Chicago y es responsable de la creación de estos videos educativos sobre citometría de flujo espectral.
• 😀 La citometría de flujo espectral, como la Aurora, difiere de los citómetros de flujo convencionales al capturar el espectro completo de las fluorocromas, lo que permite distinguir mejor los fluoróforos.
• 😀 En la citometría de flujo convencional, los detectores están asignados a un solo rango de longitudes de onda, lo que puede resultar en la pérdida de información relevante.
• 😀 El sistema Aurora tiene cinco láseres (ultravioleta, violeta, azul, amarillo, verde y rojo) y 64 detectores, lo que le permite capturar un espectro mucho más amplio.
• 😀 El proceso de diseño de paneles es esencial para obtener los mejores datos, y es crucial seleccionar controles de referencia adecuados.
• 😀 Es importante traer siempre controles sin teñir en los experimentos con Aurora, algo que no siempre es necesario en los citómetros convencionales.
• 😀 La citometría de flujo espectral permite identificar firmas espectrales únicas para cada fluoróforo, lo que aumenta el número de marcadores que se pueden usar en un panel.
• 😀 Aunque se pueden separar fluoróforos con firmas espectrales similares (como APC y AF647), no se recomienda usar demasiados fluoróforos superpuestos en un solo panel.
• 😀 La extracción de autofluorescencia de las células es crucial para mejorar la separación de las señales de fondo, como se demuestra al comparar muestras teñidas con y sin la extracción de autofluorescencia.
• 😀 La unmixing espectral convierte los datos crudos en datos no mezclados, y es un paso esencial para analizar los datos correctamente. Sin controles adecuados, no se puede realizar un proceso de unmixing exitoso.

Q & A

¿Qué es la citometría de flujo espectral y cómo se diferencia de la citometría de flujo convencional?

La citometría de flujo espectral es una técnica avanzada que utiliza un espectro completo de fluorescencia para analizar muestras, a diferencia de los citómetros de flujo convencionales, que solo capturan una parte del espectro de fluorescencia. Esto permite distinguir fluoróforos con firmas espectrales más complejas y ampliar el número de marcadores posibles en un panel.

¿Por qué es importante usar controles de referencia de alta calidad en los experimentos con Aurora?

Usar controles de referencia de alta calidad es fundamental porque permite obtener datos precisos y fiables. Los controles, como los controles de tinción simple, aseguran que cada fluoróforo se detecte correctamente y que el algoritmo de desenmascarado espectral funcione eficazmente para separar las señales de cada fluoróforo.

¿Qué es el 'unmixing' espectral y cómo difiere de la compensación en citometría convencional?

El 'unmixing' espectral es un proceso algorítmico que separa las señales de fluoróforos que se superponen en un experimento. A diferencia de la compensación en citometría convencional, que ajusta las señales de fluoróforos en canales específicos, el 'unmixing' utiliza la firma espectral completa de cada fluoróforo para realizar esta separación.

¿Por qué es necesario traer células no teñidas al utilizar el citómetro Aurora?

Es necesario traer células no teñidas porque el Aurora requiere una referencia para calcular el fondo y la autofluorescencia de las células. Las células no teñidas proporcionan un control esencial para el proceso de 'unmixing' y para asegurarse de que el algoritmo funcione correctamente.

¿Cuál es la configuración de láseres en el citómetro Aurora y cuántos detectores tiene?

El citómetro Aurora está configurado con cinco láseres: ultravioleta, violeta, azul, amarillo-verde y rojo. Estos láseres están asociados con un total de 64 detectores que cubren el espectro completo de fluorescencia visible.

¿Cómo afecta el uso de fluoróforos con firmas espectrales muy similares en un panel de Aurora?

El uso de fluoróforos con firmas espectrales muy similares puede dificultar la separación de las señales, pero el 'unmixing' espectral permite diferenciar entre estos fluoróforos. Sin embargo, no se recomienda usar muchos fluoróforos con firmas similares, especialmente en paneles pequeños, para evitar complicaciones en el análisis.

¿Qué sucede si no se cumplen los requisitos del algoritmo de 'unmixing' en el citómetro Aurora?

Si no se cumplen los requisitos del algoritmo, como la falta de un control de células no teñidas, no será posible realizar el 'unmixing' y no se podrán generar archivos de datos que puedan ser analizados. Es fundamental seguir estos requisitos para obtener resultados válidos.

¿Qué son los controles de tinción simple y cómo se utilizan en los experimentos?

Los controles de tinción simple son muestras teñidas con un solo fluoróforo que se utilizan para calibrar el citómetro y asegurarse de que cada fluoróforo se detecte de manera correcta. Estos controles ayudan a establecer las señales base para el 'unmixing' espectral.

¿Cuáles son los pasos típicos al preparar una muestra para el citómetro Aurora?

Los pasos típicos incluyen traer células no teñidas, correr controles de referencia (tinción simple), realizar el 'unmixing' espectral si es necesario, y luego correr las muestras completamente teñidas para su análisis. Este flujo de trabajo asegura que los datos sean lo más precisos posible.

¿Qué es el 'mixing matrix' y cómo ayuda en el proceso de 'unmixing'?

El 'mixing matrix' es una matriz que se utiliza en el algoritmo de 'unmixing' para descomponer las señales combinadas de fluoróforos en sus componentes individuales. Este proceso permite separar las contribuciones de cada fluoróforo a la señal total observada en una muestra.