Video 3: Extracción de RNA, transcripción reversa y qPCR
Summary
TLDREl script del video presenta un tour por el laboratorio de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes, perteneciente a la Facultad de Medicina de la UNAM. Se describen técnicas como la extracción de RNA, la transcripción reversa y la PCR en tiempo real, fundamentales para la cuantificación y análisis de la expresión génica. El proceso detalla los pasos para la purificación de RNA, la síntesis de cDNA y la medición de la concentración y pureza de la muestra, culminando en el análisis de expresión relativa de los genes, lo que es esencial en la investigación de enfermedades.
Takeaways
- 🧪 El laboratorio mencionado es parte de la Unidad Periférica de la Facultad de Medicina de la UNAM y está ubicado en el Hospital Infantil de México Federico Gómez.
- 🔬 Los videos del laboratorio enseñarán técnicas de biología molecular y cultivo celular.
- 🧴 La extracción de ARN es una técnica clave en el laboratorio, que implica la separación del ARN del ADN para análisis posterior.
- ❄️ Es crucial mantener las muestras en hielo durante la extracción para prevenir la degradación del ARN.
- 🔮 Se utiliza un buffer específico para homogeneizar y procesar la muestra de ARN.
- 🌀 La columna de filtración es una herramienta clave en la purificación del ARN, requiriendo activación y lavado posterior.
- 💧 Se añaden diferentes volúmenes de isopropanol y buffers de lavado para purificar el ARN.
- 🔬 La centrifugación es un paso importante para separar componentes y purificar el ARN.
- 📏 La medición de la absorbancia a 260 y 280 nanómetros permite cuantificar la concentración y pureza del ARN.
- 🔄 La transcripción reversa es el proceso de síntesis de ADN a partir del ARN, utilizando un conjunto de reactivos específicos.
- 🔬 La PCR en tiempo real es una técnica utilizada para cuantificar indirectamente la cantidad de ARN mensajero o de transcripción.
- 📊 El análisis de cétésis (CT) es esencial para calcular la expresión relativa de los genes, comparándolos con un gen control.
Q & A
¿Qué laboratorio se presenta en el video?
-El laboratorio presentado es el de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes, parte de la unidad periférica de la facultad de medicina de la UNAM en el Hospital Infantil de México Federico Gómez.
¿Qué técnicas se muestran en los videos del laboratorio?
-Se muestran técnicas de biología molecular y cultivo celular, incluyendo la extracción de ARN, la transcripción reversa y la PCR en tiempo real.
¿Cuál es el propósito de la extracción de ARN (errónea)?
-La extracción de ARN se realiza para separarlo del ADN con el fin de cuantificarlo, manipularlo o realizar el análisis de la expresión génica.
¿Qué es importante tener en cuenta durante la extracción de ARN?
-Es importante mantener las muestras en hielo durante todo el proceso para evitar la degradación del ARN.
¿Cómo se activa una columna para la extracción de ARN?
-La activación de la columna se hace añadiendo 100 microlitros del buffer de activación a la columna y centrifugándola a 10,000 g por 30 segundos.
¿Cuántos lavados se realizan durante el proceso de extracción de ARN y qué se hace en cada uno?
-Se realizan dos lavados. En el primer lavado se añaden 700 microlitros del buffer de lavado y se centrifuga. En el segundo lavado se repiten los pasos pero con 700 mililitros del buffer de segundo lavado.
¿Cómo se procede a secar la columna después de los lavados?
-Se deja secar la columna centrifugándola nuevamente a 10,000 g por 2 minutos.
¿Qué se añade al ARN para el proceso de ilusión y cuánto tiempo se incuba?
-Se añaden 30 a 50 microlitros de agua o buffer de ilusión al centro de la columna que contiene la erróneas y se incuba durante un minuto a temperatura ambiente.
¿Cómo se cuantifica la concentración y pureza del ARN?
-Se mide la absorbancia a 260 y 280 nanómetros para cuantificar la concentración y pureza del ARN.
¿Qué es la transcripción reversa y qué se necesita para realizarla?
-La transcripción reversa es la síntesis de cDNA a partir del ARN. Se necesita agua libre de nucleasas, buffer, dNTPs, inhibidor de RNasa, mezcla de NTP y la enzima transcriptasa reversa.
¿Para qué se usa la PCR en tiempo real y cómo se realiza?
-La PCR en tiempo real se usa para cuantificar indirectamente la cantidad de ARN mensajero o de transmet. Se realiza mezclando buffer, dNTPs, agua libre de masas, sondas fluorescentes específicas y la cDNA, y se lleva a cabo en un termociclador con las condiciones adecuadas.
Outlines
🔬 Procedimientos de laboratorio en enfermedades metabólicas
El primer párrafo introduce al laboratorio de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes, que es parte de la unidad periférica de la Facultad de Medicina de la UNAM. Se describen técnicas de biología molecular y cultivo celular, destacando la extracción de ARN erróneo, su cuantificación y manipulación para análisis de expresión génica. Se mencionan los pasos detallados para la extracción, desde la homogeneización con buffer hasta la centrifugación y el lavado de la columna, y finalmente la elución del ARN. También se incluye la medición de la concentración y pureza del ARN a través de la absorción a 260 y 280 nanómetros, y se indica cómo se debe almacenar el ARN.
🧬 Análisis de expresión génica mediante RT-PCR en tiempo real
El segundo párrafo se centra en la síntesis deARN a partir del ARN erróneo mediante la transcripción reversa, detallando los reactivos necesarios y el proceso de mezcla y homogeneización. Se describe el proceso de PCR en tiempo real para la cuantificación indirecta de ARN mensajero, incluyendo los componentes de la mezcla de reacción y la importancia de las sondas fluorescentes específicas y del gen control. Se menciona la optimización de la cantidad de ARN y la realización de la reacción por triplicado. Finalmente, se aborda el análisis de datos para calcular la expresión relativa de los genes utilizando el método delta del t act.
Mindmap
Keywords
💡Metabólicas
💡Biología Molecular
💡Cultivo Celular
💡Extracción de ARN
💡Transcripción Reversa
💡PCR en Tiempo Real
💡Absortiometría
💡Buffer
💡Termociclador
💡Expresión Relativa de Gen
Highlights
El laboratorio de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes forma parte de la Unidad Periférica de la Facultad de Medicina de la UNAM.
Se muestran técnicas de biología molecular y cultivo celular utilizadas en el laboratorio.
La extracción de RNA implica la separación de RNA del ADN para su cuantificación y análisis de expresión génica.
Es crucial mantener las muestras en hielo para evitar la degradación de la RNA durante el proceso de extracción.
Se utiliza un buffer del ISISSY para homogeneizar la muestra y separar la RNA.
La columna se activa con un buffer específico y se centrifuga para prepararla para la extracción.
Se añaden 360 microlitros de isopropanol a la muestra para el proceso de filtrado.
Dos lavados se realizan con buffers de lavado para purificar la RNA extraída.
La columna se seca离心ugando a 10,000 g por 2 minutos para eliminar el resto de líquido.
La RNA se eluye con agua o buffer para su uso en futuras reacciones.
La concentración y pureza de la RNA se miden a través de la absorción a 260 y 280 nanómetros.
La transcripción reversa es la síntesis de cDNA a partir de la RNA extraída.
Se mezclan reactivos para la transcripción reversa, incluyendo agua libre de nucleasas, buffer, dNTPs y la enzima transcriptasa reversa.
1000 nanogramos de RNA se añaden por reacción para la síntesis de cDNA.
El termociclador se programa con condiciones específicas para realizar la transcripción reversa.
La PCR en tiempo real se utiliza para cuantificar indirectamente la cantidad de ARN mensajero o ARN transitorio.
La mezcla para la PCR en tiempo real incluye buffer, dNTPs, DNA polimerasa y una sonda fluorescente específica.
Es importante incluir una onda fluorescente para un gen control en la PCR en tiempo real.
La cantidad de cDNA se optimiza para cada muestra en la PCR en tiempo real.
La PCR en tiempo real se realiza en el termociclador con condiciones de incubación específicas.
El análisis de cíclos de denaturación se hace para calcular la expresión relativa de los genes.
La expresión relativa se calcula según el método del delta del t act para la cuantificación de la expresión de un gen.
Transcripts
[Música]
y bienvenidos al laboratorio de
enfermedades metabólicas obesidad y
diabetes este laboratorio es parte de la
unidad periférica de la facultad de
medicina de la unam en el hospital
infantil de méxico federico gómez en
estos vídeos les mostraremos técnicas de
biología molecular y cultivo celular que
utilizamos en nuestro laboratorio
extracción de errónea
la extracción de la errónea consiste en
la separación del errónea del dna con el
fin de cuantificar lo manipularlo o
hacer el análisis de la expresión génica
se añade el buffer del issys a la
muestra de interés se homogeniza la
muestra con el buffer del issys es
importante cuidar que las muestras
permanezcan en hielo durante todo este
tiempo para evitar la degradación de la
errónea se coloca una columna en un tubo
colector de 2 mililitros la activación
de la columna se hace añadiendo 100
microlitros del buffer de activación a
la columna se centrífuga esta columna a
10.000 genes por 30 segundos se descarta
el filtrado
por otra parte a nuestra muestra se le
añaden 360 microlitros de isopropanol a
esta mezcla se transfiere directamente a
la columna anteriormente activada 60 y
fuga a 10.000 es por 30 segundos
se descarta el filtrado y se llevan a
cabo dos lavados al primer lavado se
añaden 700 microlitros del buffer de
lavado 60 y fugan a 10.000 g por 30
segundos se descarta el filtrado luego
el segundo lavado se añaden 700
mililitros del buffer de segundo lado 60
y fugan a 10000 cesc por 30 segundos se
descarta el filtrado y se deja secar la
columna centrifugando lo nuevamente a 10
mil genes por 2 minutos
posteriormente la columna se pone en un
nuevo tubo para louis el errónea se
añaden de 30 a 50 mililitros de agua o
buffer de ilusión este volumen debe de
ser añadido al centro de la columna que
contiene la erróneas se deja incubar por
un minuto a temperatura ambiente
finalmente se centrífuga a 10.000 genes
por un minuto y en el oído es el que
contiene el
y se cuantifica la concentración y
pureza de lerner midiendo la absorban
cya a 260 y 280 nanómetros nuestra
muestra de errónea se puede almacenar a
menos 20 grados centígrados oa menos 80
grados centígrados
transcripción reversa
la transcripción reversa es la síntesis
de cdn a a partir del errónea
la mezcla de reacción contiene los
siguientes reactivos agua libre de
nucleasas buffer framers desde t
inhibidor de erne asas mezcla de de ntp
y la enzima transcriptasa reversa
todos estos reactivos se mezclan y se
homogenizan
la mezcla de reacción se divide en los
tubos del número de muestras a procesar
se añade a cada uno de estos pozos 1000
nanogramos de rn a por reacción
posteriormente se programa el
termociclador con las condiciones
especiales para realizar la
transcripción reversa se colocan los
tubos en el termociclador y se lleva a
cabo la reacción
terminada la reacción los tubos pueden
ser almacenados a menos 20 grados
centígrados pcr en tiempo real la pcr en
tiempo real se emplea para cuantificar
de forma indirecta la cantidad de rn a
mensajero o de transmito los componentes
de esta mezcla son el buffer la dna
polimerasa la mezcla de de ntp es agua
libre de masas y la sonda fluorescente
específica para nuestro transcrito es
importante también tener las ondas
fluorescentes para un gen control estos
componentes se homogenizan con la ayuda
del vortex se centrifugan y se deposita
la mezcla en cada uno de los tubos
posteriormente se añade el cdn a en cada
uno de los tubos
considerar que esta reacción se debe de
hacer por triplicado para cada muestra
por otra parte es importante optimizar
la cantidad de cdn para cada gel se
cierran los tubos se concentra la mezcla
de reacción al fondo de los tubos por
medio de la centrífuga se realiza la
reacción de peces de tiempo real en el
termociclador las condiciones de
incubación son
terminada la reacción se hará el
análisis de cetes para calcular la
expresión relativa de los genes esta
expresión relativa se hace de acuerdo al
que en control el análisis se hace por
el método de delta del t act
para la cuantificación de la expresión
de un gen es necesario extraer la
errónea realizar la transcripción
reversa y medirá al transcrito por medio
de una pcr en tiempo real
[Música]
[Música]
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