Clonage moléculaire

Biofacile

25 Sept 201905:24

Summary

TLDRCette vidéo explique le processus de clonage moléculaire, qui consiste à insérer un gène d'intérêt dans un plasmide, un vecteur permettant l'expression du gène dans une cellule. Le plasmide contient des éléments essentiels pour la transcription du gène, ainsi qu'un gène de résistance pour sélectionner les cellules qui ont intégré le plasmide. Après avoir effectué des coupures avec des enzymes de restriction et ligaturé le plasmide, celui-ci est introduit dans des bactéries par transformation. Ces dernières, exposées à un antibiotique, permettent de sélectionner celles contenant le plasmide et d'obtenir une grande quantité de plasmides pour des expériences futures.

Takeaways

😀 Le clonage moléculaire consiste à insérer un gène d'intérêt dans un plasmide, qui agit comme un vecteur pour l'expression du gène dans une cellule.
😀 Le plasmide contient tous les éléments nécessaires pour exprimer le gène, y compris un promoteur pour la transcription du gène et des éléments de protection contre la dégradation.
😀 Le plasmide permet aussi la réplication dans la cellule, augmentant ainsi le nombre de copies du gène cloné.
😀 L'un des avantages du clonage moléculaire est qu'il permet de sélectionner les cellules ayant intégré le plasmide grâce à un gène de résistance aux antibiotiques.
😀 Le clonage commence par l'utilisation d'enzymes de restriction pour couper à la fois le plasmide et le gène à cloner.
😀 Après avoir découpé le plasmide et l'insert avec des enzymes de restriction, les extrémités doivent être complémentaires pour faciliter leur ligation.
😀 La ligation des fragments plasmidiques et du gène inséré forme un nouveau plasmide contenant le gène d'intérêt.
😀 Ce plasmide recombinant est ensuite introduit dans des bactéries par un processus appelé transformation.
😀 Les bactéries transformées sont cultivées dans un milieu contenant un antibiotique pour sélectionner uniquement celles ayant intégré le plasmide.
😀 Après 18 heures de culture, les bactéries transformées sont sélectionnées, et le plasmide amplifié peut être extrait et analysé pour vérifier sa qualité.
😀 La vérification de la qualité du plasmide inclut une digestion enzymatique suivie d'une analyse par électrophorèse sur gel pour confirmer la présence du gène inséré.

Q & A

Qu'est-ce que le clonage moléculaire ?
-Le clonage moléculaire consiste à insérer un gène d'intérêt dans un vecteur plasmidique pour le dupliquer ou l'exprimer dans des cellules. Le plasmide contient des éléments nécessaires pour l'expression du gène cloné, comme un promoteur et des sites de sélection.
Pourquoi utilise-t-on un plasmide dans le clonage moléculaire ?
-Un plasmide est utilisé car il contient tous les éléments nécessaires pour exprimer un gène dans une cellule. Il protège également le gène de la dégradation, permet la réplication dans la cellule et facilite la sélection des cellules ayant intégré le gène d'intérêt.
Qu'est-ce qu'un vecteur plasmidique dans le clonage moléculaire ?
-Un vecteur plasmidique est un plasmide utilisé comme véhicule pour transporter un gène d'intérêt dans une cellule hôte. Il contient des éléments comme un promoteur, des sites de clonage, et parfois des gènes de résistance pour la sélection des cellules transfectées.
Quel rôle joue le promoteur dans le clonage moléculaire ?
-Le promoteur est une séquence d'ADN qui permet la transcription du gène cloné dans la cellule hôte. Il est essentiel pour assurer que le gène d'intérêt soit exprimé correctement après l'insertion dans le plasmide.
Qu'est-ce qu'un site de clonage multiple ?
-Un site de clonage multiple (ou MCS pour Multi Cloning Site) est une région d'un plasmide contenant plusieurs sites de restriction où un gène d'intérêt peut être inséré. Cela facilite l'insertion du gène dans le vecteur en utilisant différentes enzymes de restriction.
Comment fonctionne la sélection des cellules après le clonage ?
-La sélection se fait par l'utilisation d'un gène de résistance aux antibiotiques intégré dans le plasmide. Après transformation, seules les cellules ayant intégré le plasmide avec le gène de résistance survivront dans un milieu contenant l'antibiotique, permettant ainsi de les identifier.
Quel est le principe de la digestion enzymatique dans le clonage moléculaire ?
-La digestion enzymatique consiste à utiliser des enzymes de restriction pour couper à des endroits spécifiques dans l'ADN. Dans le clonage moléculaire, cela permet d'ouvrir le plasmide et de préparer le gène d'intérêt pour son insertion dans le vecteur.
Pourquoi est-il important que les extrémités du plasmide et du gène d'intérêt soient complémentaires ?
-Les extrémités complémentaires permettent aux deux morceaux d'ADN, le vecteur et le gène d'intérêt, de se lier de manière stable et spécifique lors de la ligation, assurant ainsi que l'insertion se fasse correctement.
Qu'est-ce que la transformation bactérienne dans le clonage moléculaire ?
-La transformation bactérienne est le processus par lequel des bactéries absorbent un plasmide contenant un gène d'intérêt. Cela permet aux bactéries de produire des copies du plasmide et d'exprimer le gène inséré.
Comment vérifier la qualité d'un plasmide cloné ?
-La qualité d'un plasmide cloné peut être vérifiée par digestion enzymatique, suivie d'une analyse sur gel d'agarose. Cela permet de confirmer la taille du plasmide et la présence du gène inséré. Un bon plasmide cloné donnera les bandes attendues sur le gel.