Next Generation Sequencing Library Preparation - Seq It Out #10

Summary

In diesem Video wird die Vorbereitung von Next Generation Sequencing (NGS) Bibliotheken erklärt, die entscheidend für die Qualität der Sequenzierung sind. Der Prozess umfasst vier Hauptschritte: 1) DNA-Fragmente erstellen, entweder durch Fragmentierung oder gezielte Amplifikation. 2) Hinzufügen spezifischer Adaptersequenzen an die DNA-Enden. 3) Auswahl der Fragmentgrößen mittels Gel-Elektrophorese oder Bead-basierten Methoden. 4) Quantifizierung und Qualitätskontrolle der Bibliothek, um eine erfolgreiche Sequenzierung zu gewährleisten. Ein tiefes Verständnis dieser Schritte ist entscheidend, um hochwertige Sequenzierungsdaten zu erhalten.

Takeaways

• 😀 Ein NGS-Bibliothek besteht aus einer Sammlung von DNA-Fragmenten mit bekannten Adaptersequenzen an den Enden.
• 😀 Die vier grundlegenden Schritte der NGS-Bibliotheksvorbereitung sind DNA-Fragmente, Adaptersynthese, Größenwahl und Bibliotheksquantifizierung.
• 😀 Die Fragmentierung von DNA kann physikalisch oder enzymatisch erfolgen, um die DNA in kleinere Stücke zu zerlegen.
• 😀 Wenn spezifische DNA-Ziele bekannt sind, können diese durch PCR-Amplifikation in gewünschte Größen hergestellt werden.
• 😀 Zu den Adaptersequenzen gehören zwei verschiedene Sequenzen, die an den DNA-Fragmenten befestigt sind: eine für den Sequenzierungsprimer und eine zum Anheften der Fragmente.
• 😀 Die Auswahl der Fragmentgröße ist wichtig für die Effizienz und die Qualität der DNA-Sequenzierung.
• 😀 Gel-Elektrophorese und magnetische Beads sind zwei gängige Methoden zur Größenwahl von Bibliotheksfragmenten.
• 😀 Bei Amplifikationsbibliotheken ist die Größenwahl normalerweise nicht erforderlich, da die PCR-Produkte bereits im gewünschten Größenbereich entworfen wurden.
• 😀 Eine genaue Quantifizierung der Bibliothek ist entscheidend für die erfolgreiche Vorbereitung von Vorlagen und die Sequenzierung.
• 😀 Methoden zur Quantifizierung sind die Bioanalyzer-Analyse und qPCR, wobei qPCR die genaueste Quantifizierung bietet.

Q & A

Was ist eine NGS-Bibliothek?

Eine NGS-Bibliothek ist eine Sammlung von DNA-Fragmenten mit bekannten Adaptersequenzen an den 5'- und 3'-Enden, die zur Sequenzierung vorbereitet werden.

Welche sind die vier grundlegenden Schritte der NGS-Bibliotheksvorbereitung?

Die vier Schritte sind: DNA-Fragmente oder Zielauswahl, Hinzufügen von Adaptersequenzen, Größenauswahl und abschließende Bibliotheksquantifizierung und Qualitätssicherung (QC).

Wie erfolgt die DNA-Fragmente oder Zielauswahl?

Isolierte DNA wird durch physikalische oder enzymatische Methoden in kleinere Stücke fragmentiert. Alternativ kann die PCR-Amplifikation verwendet werden, um spezifische DNA-Ziele zu produzieren.

Was sind die Adaptersequenzen und warum sind sie wichtig?

Adaptersequenzen sind kurze DNA-Abschnitte, die an die Fragmente angeheftet werden, um die Sequenzierung zu ermöglichen und die DNA an einer Oberfläche zu verankern.

Welche Methoden zur Größenauswahl gibt es?

Es gibt zwei gängige Methoden zur Größenauswahl: Gel-Elektrophorese, bei der die Fragmente nach Größe getrennt werden, und eine bead-basierte Methode, bei der magnetische Perlen verwendet werden.

Warum ist die Quantifizierung der Bibliothek wichtig?

Die genaue Quantifizierung der Bibliothek ist entscheidend für die erfolgreiche Vorbereitung des Templates und die Durchführung der Sequenzierung.

Welche Methoden zur Bibliotheksquantifizierung werden häufig verwendet?

Häufig verwendete Methoden sind das Bioanalyzer-System, das sowohl die Konzentration als auch die Fragmentgröße bestimmt, und qPCR, das die quantifizierbaren Fragmente misst.

Was sind die Vorteile der Verwendung von Fragmentbibliotheken?

Fragmentbibliotheken ermöglichen die Analyse einer Vielzahl von DNA-Fragmenten und sind nützlich, wenn die Zielsequenzen unbekannt sind.

Wie beeinflusst die Qualität der Bibliothek die Sequenzierung?

Die Qualität der Bibliothek hat direkten Einfluss auf die Effizienz und Genauigkeit der Sequenzierung, da fehlerhafte Bibliotheken zu schlechten Daten führen können.

Wo kann ich weitere Informationen zur NGS-Bibliotheksvorbereitung finden?

Weitere Informationen finden Sie auf der Website von Thermo Fisher oder durch das Abonnieren des entsprechenden Bildungskanals.