Next Generation Sequencing Library Preparation - Seq It Out #10

Thermo Fisher Scientific

23 Oct 201504:49

Summary

TLDRIn diesem Video wird die Vorbereitung von Next Generation Sequencing (NGS) Bibliotheken erklärt, die entscheidend für die Qualität der Sequenzierung sind. Der Prozess umfasst vier Hauptschritte: 1) DNA-Fragmente erstellen, entweder durch Fragmentierung oder gezielte Amplifikation. 2) Hinzufügen spezifischer Adaptersequenzen an die DNA-Enden. 3) Auswahl der Fragmentgrößen mittels Gel-Elektrophorese oder Bead-basierten Methoden. 4) Quantifizierung und Qualitätskontrolle der Bibliothek, um eine erfolgreiche Sequenzierung zu gewährleisten. Ein tiefes Verständnis dieser Schritte ist entscheidend, um hochwertige Sequenzierungsdaten zu erhalten.

Takeaways

😀 Ein NGS-Bibliothek besteht aus einer Sammlung von DNA-Fragmenten mit bekannten Adaptersequenzen an den Enden.
😀 Die vier grundlegenden Schritte der NGS-Bibliotheksvorbereitung sind DNA-Fragmente, Adaptersynthese, Größenwahl und Bibliotheksquantifizierung.
😀 Die Fragmentierung von DNA kann physikalisch oder enzymatisch erfolgen, um die DNA in kleinere Stücke zu zerlegen.
😀 Wenn spezifische DNA-Ziele bekannt sind, können diese durch PCR-Amplifikation in gewünschte Größen hergestellt werden.
😀 Zu den Adaptersequenzen gehören zwei verschiedene Sequenzen, die an den DNA-Fragmenten befestigt sind: eine für den Sequenzierungsprimer und eine zum Anheften der Fragmente.
😀 Die Auswahl der Fragmentgröße ist wichtig für die Effizienz und die Qualität der DNA-Sequenzierung.
😀 Gel-Elektrophorese und magnetische Beads sind zwei gängige Methoden zur Größenwahl von Bibliotheksfragmenten.
😀 Bei Amplifikationsbibliotheken ist die Größenwahl normalerweise nicht erforderlich, da die PCR-Produkte bereits im gewünschten Größenbereich entworfen wurden.
😀 Eine genaue Quantifizierung der Bibliothek ist entscheidend für die erfolgreiche Vorbereitung von Vorlagen und die Sequenzierung.
😀 Methoden zur Quantifizierung sind die Bioanalyzer-Analyse und qPCR, wobei qPCR die genaueste Quantifizierung bietet.

Q & A

Was ist eine NGS-Bibliothek?
-Eine NGS-Bibliothek ist eine Sammlung von DNA-Fragmenten mit bekannten Adaptersequenzen an den 5'- und 3'-Enden, die zur Sequenzierung vorbereitet werden.
Welche sind die vier grundlegenden Schritte der NGS-Bibliotheksvorbereitung?
-Die vier Schritte sind: DNA-Fragmente oder Zielauswahl, Hinzufügen von Adaptersequenzen, Größenauswahl und abschließende Bibliotheksquantifizierung und Qualitätssicherung (QC).
Wie erfolgt die DNA-Fragmente oder Zielauswahl?
-Isolierte DNA wird durch physikalische oder enzymatische Methoden in kleinere Stücke fragmentiert. Alternativ kann die PCR-Amplifikation verwendet werden, um spezifische DNA-Ziele zu produzieren.
Was sind die Adaptersequenzen und warum sind sie wichtig?
-Adaptersequenzen sind kurze DNA-Abschnitte, die an die Fragmente angeheftet werden, um die Sequenzierung zu ermöglichen und die DNA an einer Oberfläche zu verankern.
Welche Methoden zur Größenauswahl gibt es?
-Es gibt zwei gängige Methoden zur Größenauswahl: Gel-Elektrophorese, bei der die Fragmente nach Größe getrennt werden, und eine bead-basierte Methode, bei der magnetische Perlen verwendet werden.
Warum ist die Quantifizierung der Bibliothek wichtig?
-Die genaue Quantifizierung der Bibliothek ist entscheidend für die erfolgreiche Vorbereitung des Templates und die Durchführung der Sequenzierung.
Welche Methoden zur Bibliotheksquantifizierung werden häufig verwendet?
-Häufig verwendete Methoden sind das Bioanalyzer-System, das sowohl die Konzentration als auch die Fragmentgröße bestimmt, und qPCR, das die quantifizierbaren Fragmente misst.
Was sind die Vorteile der Verwendung von Fragmentbibliotheken?
-Fragmentbibliotheken ermöglichen die Analyse einer Vielzahl von DNA-Fragmenten und sind nützlich, wenn die Zielsequenzen unbekannt sind.
Wie beeinflusst die Qualität der Bibliothek die Sequenzierung?
-Die Qualität der Bibliothek hat direkten Einfluss auf die Effizienz und Genauigkeit der Sequenzierung, da fehlerhafte Bibliotheken zu schlechten Daten führen können.
Wo kann ich weitere Informationen zur NGS-Bibliotheksvorbereitung finden?
-Weitere Informationen finden Sie auf der Website von Thermo Fisher oder durch das Abonnieren des entsprechenden Bildungskanals.