Practica No 3

Summary

En esta clase se revisan técnicas de biología molecular como RT-PCR, microarreglos e hibridación in situ. Se describe cómo la RT-PCR permite analizar la expresión génica a través del ARN mensajero y los métodos de retrotranscripción necesarios. Los microarreglos son explicados como una técnica avanzada para estudiar la expresión de múltiples genes simultáneamente. Además, se profundiza en la hibridación in situ con fluorescencia, una técnica útil para detectar secuencias específicas en cromosomas o tejidos y sus aplicaciones en el estudio de enfermedades como el cáncer.

Takeaways

• 🧬 La práctica número 3 abarca RT-PCR, microarreglos e hibridación in situ, enfocándose en el análisis del ARN mensajero para determinar si un gen está activo o inactivo.
• 🧫 La extracción del ARN varía según el tipo de muestra (líquida o tejido) y se puede realizar mediante métodos enzimáticos, mecánicos o de congelación.
• 🔬 Para realizar la PCR, se requiere una retrotranscripción de ARN mensajero a ADN complementario utilizando métodos como oligo dT primer, random primers, o primers específicos.
• 📈 La PCR amplifica el ADN de manera cíclica, controlada por un termociclador, para observar la expresión del gen de interés en tiempo real usando detectores de fluorescencia como SYBR Green.
• 🧪 Los microarreglos permiten estudiar la expresión de múltiples genes simultáneamente en un chip, donde la hibridación de secuencias génicas emite luz si hay expresión genética.
• 🔍 La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se usa para visualizar secuencias específicas de ADN o ARN en muestras de tejido o cromosomas mediante sondas marcadas.
• 🧫 El proceso de FISH incluye fijar la muestra, hibridar la sonda fluorescente, y visualizar la unión bajo un microscopio para detectar deleciones, duplicaciones o translocaciones.
• 🧬 Las técnicas de FISH también permiten detectar anomalías cromosómicas, como trisomías, y son útiles para el seguimiento de enfermedades genéticas y cáncer.
• 🧫 Se pueden utilizar técnicas de FISH en muestras de tejidos para estudiar interacciones bacterianas y estructurales, como la translocación de E. coli en el intestino.
• 📊 RT-PCR se usa para cuantificar la expresión de genes específicos, mientras que los microarreglos permiten un análisis amplio de muchos genes, y la hibridación in situ identifica la localización precisa de genes o proteínas.

Q & A

¿Qué es la RT-PCR y para qué se utiliza?

La RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa) es una técnica que permite analizar la expresión génica a través del ARN mensajero de un gen de interés. Se utiliza para determinar si un gen está activo o inactivo en una célula.

¿Cuál es el primer paso en el proceso de RT-PCR?

El primer paso es la extracción del ARN de una muestra, que puede ser una biopsia de tejido o una muestra líquida. Existen diferentes métodos como mecánicos, enzimáticos o de congelación para disociar las células y extraer el ARN.

¿Qué son los oligo(dT) primers y cómo funcionan en la retrotranscripción?

Los oligo(dT) primers son secuencias de timinas que se hibridan con la cola poli-A del ARN mensajero. Al retrotranscribir con estos primers, solo se retrotranscriben los ARN mensajeros que tienen la cola poli-A, excluyendo otros tipos de ARN.

¿Cuál es la diferencia entre usar oligo(dT) primers y random primers?

Los oligo(dT) primers solo retrotranscriben ARN mensajero, mientras que los random primers son secuencias aleatorias de nucleótidos que permiten retrotranscribir cualquier tipo de ARN en la muestra, permitiendo análisis más amplios.

¿Por qué se limita el número de ciclos en una PCR a 40 o 45?

Después de 40-45 ciclos, la enzima polimerasa agota los recursos disponibles, como nucleótidos y magnesio, lo que detiene la amplificación eficiente y alcanza una fase de meseta en la curva de amplificación.

¿Qué es la curva de melting en la RT-PCR y cuál es su función?

La curva de melting es un proceso que detecta la desnaturalización de los productos amplificados al aumentar gradualmente la temperatura. Permite verificar la especificidad del producto de PCR, ya que productos específicos deben desnaturalizarse a la misma temperatura.

¿Cómo funcionan los microarreglos en la expresión génica?

Los microarreglos permiten estudiar la expresión de múltiples genes simultáneamente. Se colocan secuencias génicas en un chip, y las muestras de ADN complementario hibridan con las secuencias en el chip, emitiendo luz si hay emparejamiento, lo que indica expresión génica.

¿Qué es la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) y cómo se usa?

FISH es una técnica que utiliza sondas marcadas con fluorescencia para hibridar con secuencias de ADN o ARN en una muestra. Permite visualizar la ubicación de genes o secuencias específicas en células o cromosomas mediante microscopía.

¿Para qué se utiliza la técnica de hibridación in situ en la citogenética molecular?

La hibridación in situ se utiliza para detectar anomalías cromosómicas, como deleciones, translocaciones o amplificaciones génicas, que no se pueden identificar con técnicas citogenéticas convencionales.

¿Cómo se utiliza la FISH para detectar translocaciones cromosómicas?

La FISH utiliza sondas marcadas con diferentes colores para identificar translocaciones. Si una sonda de color se fusiona con otra en un cromosoma diferente, indica que ha ocurrido una translocación entre esos cromosomas.