Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - Biochemie - Labormethoden - AMBOSS Video

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12 Oct 201605:31

Summary

TLDRDie Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine molekularbiologische Methode zur Vervielfältigung von DNA-Abschnitten. Sie basiert auf der zellulären DNA-Replikation, wird aber in vitro durchgeführt. Durch den Einsatz von DNA-Polymerase und Primern, die die zu verlängernden DNA-Stränge angeben, werden spezifische DNA-Stücke exponentiell vervielfältigt. Die Prozessschritte beinhalten Denaturierung, Annealing und Elongation, die in mehreren Zyklen wiederholt werden. Die resultierende amplifizierte DNA kann für Analysen oder Anwendungen wie die Herstellung von therapeutischen Proteinen verwendet werden.

Takeaways

🔬 Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung bestimmter DNA-Abschnitte.
🌡️ PCR basiert auf den Mechanismen der zellulären DNA-Replikation und wird in vitro durchgeführt.
🔄 Die doppelsträngige DNA wird durch Hitze getrennt und anschließend mit Hilfe von DNA-Polymerase neu synthetisiert.
📈 Die Vervielfältigung erfolgt exponentiell durch wiederholte Reaktionszyklen.
🌡️ Die Temperaturzyklen bestehen aus Denaturierung (90°C), Annealing (50-60°C) und Elongation (70°C).
🧬 Die Reaktion benötigt Ausgangs-DNA, Nukleotide, eine hitzestabile DNA-Polymerase und zwei Primer.
🔬 Hitzestabile DNA-Polymerasen, wie die Taq-Polymerase, bleiben nach Erhitzung auf hohe Temperaturen funktionsfähig.
🔬 Primer sind kurze Oligonukleotide, die als Anknüpfungspunkte für die DNA-Polymerase dienen.
📈 Nach jedem Zyklus verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Moleküle, die dem gewünschten Abschnitt entsprechen.
🧫 Nach ca. 30 Zyklen kann das DNA-Fragment um den Faktor 10^6 bis 10^12 amplifiziert werden.
🔎 Die amplifizierte DNA kann mittels Gelelektrophorese analysiert und zur Detektion von Erreger-DNA verwendet werden.
🛠️ PCR wird auch für die Herstellung therapeutisch eingesetzter Proteine, wie rekombinantes Humaninsulin, genutzt.

Q & A

Was ist die Polymerasekettenreaktion (PCR)?
-Die Polymerasekettenreaktion, kurz PCR, ist eine Standardmethode der Molekularbiologie zur Vervielfaeltigung bestimmter Abschnitte doppelstraengiger DNA in vitro.
Wie basiert das Grundprinzip der PCR?
-Das Grundprinzip der PCR basiert auf den Mechanismen der zellulaeren DNA-Replikation, wobei die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufgespalten und anschließend von einer DNA-Polymerase neu synthetisiert wird.
Was ist das Ziel der PCR?
-Das Ziel der PCR ist es, einen spezifisch festgelegten DNA-Abschnitt exponentiell zu vervielfältigen, also zu amplifizieren.
Welche Rolle spielen die Primer in der PCR?
-Die Primer sind kurze Oligonukleotide, die als Anknüpfungspunkte für die DNA-Polymerase dienen und den zu amplifizierenden DNA-Abschnitt in beide Richtungen begrenzen.
Welche Art von DNA-Polymerase wird in der PCR verwendet?
-In der PCR wird eine hitzestabile DNA-Polymerase verwendet, wie zum Beispiel die Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus, die auch nach Erhitzung auf hohe Temperaturen noch funktionstüchtig ist.
Was geschieht in der Denaturierungsphase der PCR?
-In der Denaturierungsphase wird die Temperatur auf 90°C erhöht, was dazu führt, dass die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufspaltet.
Was ist die Annealing-Temperatur und welche Rolle spielt sie?
-Die Annealing-Temperatur liegt zwischen 50-60°C und ist die Temperatur, bei der die Primer sequenzspezifisch an die komplementären DNA-Sequenzen anlagern können.
Was passiert in der Elongationsphase der PCR?
-In der Elongationsphase wird die Temperatur auf etwa 70°C erhöht, die optimale Arbeitstemperatur der DNA-Polymerase, um die Nukleotide an die Primer anzuhängen und den neuen DNA-Strang zu synthetisieren.
Wie viele Nukleotide sind im Reaktionsansatz der PCR enthalten?
-Im Reaktionsansatz der PCR sind vier verschiedene Nukleotide enthalten: Desoxyadenosintriphosphat, Desoxyguanosintrisphosphat, Desoxycytidintriphosphat und Desoxythymidintriphosphat.
Was kann man mit der amplifizierten DNA nach der PCR machen?
-Die amplifizierte DNA kann in einer Gelelektrophorese visualisiert, weiter analysiert oder in ein Bakteriengenom transferiert werden, um beispielsweise therapeutisch eingesetzte Proteine herzustellen.
Was ist die Bedeutung der hohen Spezifität in der PCR?
-Die hohe Spezifität der PCR ermöglicht die Nachweisbarkeit auch von schwer oder gar nicht kultivierbaren Mikroorganismen und erhöht die Genauigkeit der Erkennung und Identifizierung von DNA-Abschnitten.