Overview of Illumina Sequencing by Synthesis Workflow

Summary

El flujo de trabajo de secuenciación Illumina comprende cuatro pasos fundamentales: preparación de muestras, generación de clusters, secuenciación y análisis de datos. La preparación de muestras implica la adición de adaptadores a fragmentos de ADN. La generación de clusters es un proceso de amplificación isotérmica de fragmentos. La secuenciación utiliza la técnica de Secuenciación por Síntesis, donde se incorporan nucleótidos marcados fluorescentemente y se emiten señales según la base. La lectura se repite para obtener diferentes índices y secciones de la secuencia.

Takeaways

• 🧬 **Preparación de la muestra**: Se añaden adaptadores a los extremos de los fragmentos de ADN.
• 🔁 **Amplificación por ciclos reducidos**: Se introducen motivos adicionales como el sitio de unión de secuenciación, índices y regiones complementarias a los oligos de la celda de flujo.
• 🌡️ **Proceso de clustering**: Amplificación isotérmica de cada fragmento molecule en una celda de flujo con canales recubiertos de oligos.
• 🧬 **Hibridación**: La primera tipo de oligos en la superficie se complementa con la región del adaptador en una de las cadenas del fragmento.
• 🌉 **Amplificación por puente**: Se forma una doble cadena que se denatura y se amplifica clonalmente formando un puente de doble cadena.
• ✂️ **Post-amplificación**: Se cortan las cadenas inversas y se sellan los extremos para evitar la iniciación no deseada.
• 🔬 **Secuenciación**: Comienza con la extensión del primer primer de secuenciación y se producen lecturas mediante la adición de nucleótidos marcados con fluorescencia.
• 🌟 **Secuenciación por síntesis**: El número de ciclos determina la longitud de la lectura y la longitud de onda de la señal fluorescente determina la llamada de base.
• 📚 **Proceso paralelo**: Se secuencian cientos de millones de clústers de forma masivamente paralela.
• 🔄 **Proceso de lecturas adicionales**: Se limpia la lectura anterior, se introducen y se secuencian los índices y se repite el proceso para la lectura 2.

Q & A

¿Cuáles son los cuatro pasos básicos del flujo de trabajo de secuenciación Illumina?

Los cuatro pasos básicos del flujo de trabajo de secuenciación Illumina son: preparación de muestras, generación de clústeres, secuenciación y análisis de datos.

¿Qué métodos diferentes hay para preparar las muestras en la secuenciación Illumina?

Existen varios métodos de preparación de muestras, todos ellos añaden adaptadores a los extremos de los fragmentos de ADN.

¿Qué es la amplificación de ciclo reducido y qué se introduce durante este proceso?

La amplificación de ciclo reducido es un proceso que introduce motivos adicionales, como el sitio de unión de secuenciación, índices y regiones complementarias a los oligos de la celda de flujo.

¿Qué es la generación de clústeres y cómo se produce?

La generación de clústeres es un proceso isotérmico de amplificación de cada fragmento de ADN. Se produce en una celda de flujo, que es una lámina de vidrio con canales recubiertos de oligos.

¿Cómo se produce la hibridación en la celda de flujo durante la generación de clústeres?

La hibridación se produce gracias a los oligos en la superficie de la celda de flujo, que son complementarios a la región del adaptador en una de las cadenas del fragmento.

¿Qué sucede durante la amplificación por puente y cómo se relaciona con la formación de clústeres?

Durante la amplificación por puente, el fragmento se dobla y el adaptador se hibridiza con el segundo tipo de oligo en la celda de flujo, lo que lleva a la formación de un puente doble cadena que se denatura y se amplifica clonalmente.

¿Cuál es el propósito de clonally amplificar todos los fragmentos después de la amplificación por puente?

El propósito de la amplificación clonal es asegurar que cada fragmento de ADN se amplíque de manera idéntica y se encuentre anclado a la celda de flujo para la secuenciación.

¿Cómo se inicia la secuenciación en la secuenciación por síntesis (Sequencing-by-Synthesis)?

La secuenciación comienza con la extensión del primer primer de secuenciación para producir la primera lectura (read).

¿Qué sucede después de la adición de cada nucleótido en la secuenciación por síntesis?

Después de la adición de cada nucleótido, los clústeres son excitados por una fuente de luz y emiten una señal fluorescente característica que se utiliza para determinar la base.

¿Cuál es la relación entre el número de ciclos y la longitud de la lectura en la secuenciación por síntesis?

El número de ciclos determina la longitud de la lectura, ya que cada ciclo corresponde a la adición de un nucleótido y, por tanto, a la extensión de la cadena de ADN.

¿Cómo se realizan los índices en la secuenciación Illumina y cuál es su propósito?

Los índices se realizan después de la primera lectura, mediante la introducción y la hibridación de un primer de lectura de índice. Su propósito es identificar y diferenciar entre las muestras múltiples que se secuencian en paralelo.