Video 3: Extracción de RNA, transcripción reversa y qPCR
Summary
TLDREl script del video presenta un tour por el laboratorio de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes, perteneciente a la Facultad de Medicina de la UNAM. Se describen técnicas como la extracción de RNA, la transcripción reversa y la PCR en tiempo real, fundamentales para la cuantificación y análisis de la expresión génica. El proceso detalla los pasos para la purificación de RNA, la síntesis de cDNA y la medición de la concentración y pureza de la muestra, culminando en el análisis de expresión relativa de los genes, lo que es esencial en la investigación de enfermedades.
Takeaways
- 🧪 El laboratorio mencionado es parte de la Unidad Periférica de la Facultad de Medicina de la UNAM y está ubicado en el Hospital Infantil de México Federico Gómez.
- 🔬 Los videos del laboratorio enseñarán técnicas de biología molecular y cultivo celular.
- 🧴 La extracción de ARN es una técnica clave en el laboratorio, que implica la separación del ARN del ADN para análisis posterior.
- ❄️ Es crucial mantener las muestras en hielo durante la extracción para prevenir la degradación del ARN.
- 🔮 Se utiliza un buffer específico para homogeneizar y procesar la muestra de ARN.
- 🌀 La columna de filtración es una herramienta clave en la purificación del ARN, requiriendo activación y lavado posterior.
- 💧 Se añaden diferentes volúmenes de isopropanol y buffers de lavado para purificar el ARN.
- 🔬 La centrifugación es un paso importante para separar componentes y purificar el ARN.
- 📏 La medición de la absorbancia a 260 y 280 nanómetros permite cuantificar la concentración y pureza del ARN.
- 🔄 La transcripción reversa es el proceso de síntesis de ADN a partir del ARN, utilizando un conjunto de reactivos específicos.
- 🔬 La PCR en tiempo real es una técnica utilizada para cuantificar indirectamente la cantidad de ARN mensajero o de transcripción.
- 📊 El análisis de cétésis (CT) es esencial para calcular la expresión relativa de los genes, comparándolos con un gen control.
Q & A
¿Qué laboratorio se presenta en el video?
-El laboratorio presentado es el de enfermedades metabólicas, obesidad y diabetes, parte de la unidad periférica de la facultad de medicina de la UNAM en el Hospital Infantil de México Federico Gómez.
¿Qué técnicas se muestran en los videos del laboratorio?
-Se muestran técnicas de biología molecular y cultivo celular, incluyendo la extracción de ARN, la transcripción reversa y la PCR en tiempo real.
¿Cuál es el propósito de la extracción de ARN (errónea)?
-La extracción de ARN se realiza para separarlo del ADN con el fin de cuantificarlo, manipularlo o realizar el análisis de la expresión génica.
¿Qué es importante tener en cuenta durante la extracción de ARN?
-Es importante mantener las muestras en hielo durante todo el proceso para evitar la degradación del ARN.
¿Cómo se activa una columna para la extracción de ARN?
-La activación de la columna se hace añadiendo 100 microlitros del buffer de activación a la columna y centrifugándola a 10,000 g por 30 segundos.
¿Cuántos lavados se realizan durante el proceso de extracción de ARN y qué se hace en cada uno?
-Se realizan dos lavados. En el primer lavado se añaden 700 microlitros del buffer de lavado y se centrifuga. En el segundo lavado se repiten los pasos pero con 700 mililitros del buffer de segundo lavado.
¿Cómo se procede a secar la columna después de los lavados?
-Se deja secar la columna centrifugándola nuevamente a 10,000 g por 2 minutos.
¿Qué se añade al ARN para el proceso de ilusión y cuánto tiempo se incuba?
-Se añaden 30 a 50 microlitros de agua o buffer de ilusión al centro de la columna que contiene la erróneas y se incuba durante un minuto a temperatura ambiente.
¿Cómo se cuantifica la concentración y pureza del ARN?
-Se mide la absorbancia a 260 y 280 nanómetros para cuantificar la concentración y pureza del ARN.
¿Qué es la transcripción reversa y qué se necesita para realizarla?
-La transcripción reversa es la síntesis de cDNA a partir del ARN. Se necesita agua libre de nucleasas, buffer, dNTPs, inhibidor de RNasa, mezcla de NTP y la enzima transcriptasa reversa.
¿Para qué se usa la PCR en tiempo real y cómo se realiza?
-La PCR en tiempo real se usa para cuantificar indirectamente la cantidad de ARN mensajero o de transmet. Se realiza mezclando buffer, dNTPs, agua libre de masas, sondas fluorescentes específicas y la cDNA, y se lleva a cabo en un termociclador con las condiciones adecuadas.
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