Biochemical and Technical Concepts in the Seahorse XFp Mito Stress Test and ATP Rate Assay
Summary
TLDRDieses Skript bietet einen Einblick in die Anwendung des Seahorse XFp Zell-Stress-Tests zur Messung der Mitochondrienleistung und ATP-Produktion. Es erklärt die Konzepte der Mitochondrienatmung, des Protonenflusses und die Durchführung von Tests mit dem Seahorse-Gerät. Es werden detailliert der Mito Stress Test und die ATP Rate Assay vorgestellt, die dabei helfen, verschiedene Parameter der Zellatmung zu bestimmen und die ATP-Produktion aus Glykolyse und Mitochondrien zu quantifizieren. Zudem wird auf die Bedeutung der Zellzählung und die Optimierung der Zellzahlen für genaue Messungen hingewiesen.
Takeaways
- 🧪 Die Vorlesung behandelt biochemische und technische Konzepte im Zusammenhang mit dem Seahorse XFp Cell Mito Stress Test und der Echtzeit-ATP-Rate-Assay.
- 🔍 Man kann Mitochondrienleistung und ATP-Produktion messen, indem man spezifische Proteinfunktionen verändert und den Sauerstoffverbrauch und die extracellulare Versauerung misst.
- 🛠 Es ist möglich, mit einem Sauerstoffsensor und einem pH-Meter einen eigenen Messapparat zu bauen, aber es ist effizienter, den Seahorse XFp oder ähnliche Geräte mit dazugehörigen Reagenzkits zu verwenden.
- 🏫 Es gibt verschiedene Seahorse-Geräte auf dem Campus, einschließlich des XF24 für Gewebeproben, sodass man nicht auf ein bestimmtes Instrument beschränkt ist.
- 🔬 Die Mito Stress Test ermöglicht die Messung verschiedener Parameter wie basaler Atmung, ATP-Produktion, maximale Atmung, Reservekapazität, nicht-mitochondrialer Sauerstoffverbrauch und Protonleck.
- 📈 Die ATP-Rate-Assay erlaubt die Quantifizierung des ATP, das von den Mitochondrien produziert wird, und ermöglicht es, den ATP-Gehalt pro Zelle zu bestimmen.
- 🌡 Der Seahorse XFp misst pH und Sauerstoffverbrauch, was es einem teuren pH-Messgerät und Sauerstoffsensor gleichkommt, und erlaubt es, Zellen mit verschiedenen Substanzen zu behandeln.
- 🔄 Der Citratzyklus und die Elektronentransportkette sind für den Sauerstoffverbrauch und die ATP-Produktion in den Mitochondrien verantwortlich.
- 📉 Durch Modifikation des Sauerstoffverbrauchs kann man ableiten, wie gut verschiedene Aspekte des Citratzyklus und der Elektronentransportkette funktionieren.
- 🧫 Die Zellzählung ist entscheidend für die Genauigkeit der Normalisierung der Daten; die Verwendung von Hoechst zur Anfärbung und Zählung der Zellen hilft dabei, eine genaue Zellzahl zu erhalten.
- 🔬 Es gibt verschiedene Methoden zur Normalisierung, darunter die Bestimmung der Gesamt-DNA- oder -Proteininhalte, aber die Zellzählung ist zunehmend beliebt und bietet präzise Ergebnisse.
Q & A
Was ist das Hauptthema des Vortrags?
-Das Hauptthema des Vortrags ist die Beschreibung von biochemischen und technischen Konzepten in der Sehmaschine XFp Zell-Stresstest und der Echtzeit-ATP-Rate-Bestimmung.
Was sind die Hauptfunktionen von Mitochondrien?
-Mitochondrien haben viele Funktionen in der Zelle, von denen die meisten jedoch direkt oder indirekt mit der ATP-Produktion verbunden sind. Sie wandeln Pyruvat und Fettsäuren in Sauerstoff, ATP, Wasser und Kohlenstoffdioxid um.
Wie kann man die Leistung von Mitochondrien messen?
-Man kann die Leistung von Mitochondrien messen, indem man die Sauerstoffaufnahme und die extracellulare Säuerung misst, um verschiedene Aspekte der Mitochondrienleistung und deren ATP-Produktion zu schätzen.
Was ist das Seahorse XFp und wie wird es verwendet?
-Das Seahorse XFp ist ein Instrument, das zur Messung der Sauerstoffaufnahme und der extracellularen Säuerung verwendet wird. Es ermöglicht es, die Leistung von Mitochondrien und deren ATP-Produktion zu messen.
Was ist der Zweck des Mito Stress Tests?
-Der Mito Stress Test ermöglicht die Messung verschiedener Parameter wie basale Atmung, ATP-Produktion, maximale Atmung, Reservekapazität, nicht-mitochondriale Sauerstoffaufnahme und Proton-Leak.
Was ist die ATP-Rate-Bestimmung und welche Informationen liefert sie?
-Die ATP-Rate-Bestimmung ist ein Verfahren, das es ermöglicht, die Menge an ATP, die von den Mitochondrien und Glykolyse produziert wird, zu quantifizieren. Sie liefert Informationen über die ATP-Produktion pro Zelle und pro Minute.
Wie wird die Anzahl der Zellen in den Meeressäbler-Platten gemessen?
-Die Anzahl der Zellen wird durch das Anfärben der Meeressäbler-Platten mit Hoechst und die anschließende Zählung der Zellkerne unter einem fluoreszierenden Mikroskop gemessen.
Welche Rolle spielen Oligomycin und FCCP in den genannten Messungen?
-Oligomycin hemmt die ATP-Synthese, was die Zellen dazu zwingt, durch Proton-Leak Sauerstoff zu konsumieren. FCCP, ein Protonofor, ermöglicht es Protonen, die Membran ohne die ATP-Synthese zu durchqueren, was die maximale Atmung und Reservekapazität zeigt.
Was sind die Vorteile des Einsatzes von Seahorse XFp im Vergleich zu selbstgebauten Messeinrichtungen?
-Das Seahorse XFp ist einfacher und effizienter zu verwenden als selbstgebaute Messeinrichtungen, da es spezielle Sensoren für Sauerstoff und pH-Wert enthält und die Anwendung verschiedener Substanzen ermöglicht.
Welche anderen Assays kann man mit dem Seahorse XFp durchführen?
-Mit dem Seahorse XFp können auch andere Assays durchgeführt werden, wie der Glycolysis-Rate-Assay, der Glykolysis-Stress-Test und einige weitere, die jedoch weniger häufig in der Veröffentlichung erscheinen.
Wie ist die Bedeutung von Glykolyse für die ATP-Produktion in Zellen?
-Glykolyse ist ein weiterer Prozess in Zellen, der ATP produziert. Durch die Messung der extracellularen Säuerung kann man die Aktivität von Glykolyse und somit die ATP-Produktion durch diesen Prozess schätzen.
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