Extracción y purificación de ADN
Summary
TLDREste video educativo aborda la extracción y purificación del ADN, vital para estudios y diagnósticos en biología molecular. Se explican los métodos químicos, físicos y enzimáticos para liberar el ADN de la célula, y se describen los pasos de lisis, purificación y precipitación para obtener ADN puro. Los detalles sobre la utilización de detergentes, soluciones como el edta y cloruro de sodio, y técnicas de centrifugación para separar y purificar el ADN son destacados, culminando en su precipitación y almacenamiento para futuras investigaciones.
Takeaways
- 🧬 La extracción y purificación del ADN es fundamental para su uso en pruebas diagnósticas y estudios de biología molecular.
- 🔬 Los métodos de extracción incluyen procesos químicos, físicos y enzimáticos para liberar el ADN de la célula.
- 🧴 La lisis celular se puede realizar mediante detergentes, como el sodio dodecil sulfato (SDS), para degradar la membrana celular y liberar el ADN.
- 💧 La adición de moléculas quelantes como el EDTA ayuda a proteger el ADN evitando su degradación por enzimas.
- 🌡️ La incubación en temperaturas elevadas y agitación促进细胞膜破裂,有利于DNA的释放。
- 🧪 Los métodos físicos de lisis incluyen homogeneización mecánica, sonificación y molienda para liberar el ADN de tejidos sólidos.
- 🌀 La purificación del ADN se logra eliminando proteínas y lípidos mediante la adición de solventes orgánicos como el fenol y cloroformo.
- 📉 La centrifugación es esencial para separar las fases acuosa y orgánica, permitiendo la recuperación del ADN en la fase acuosa.
- 🥃 El uso de etanol en la precipitación del ADN ayuda a remover sales y concentraciones residuales, facilitando la recuperación del ADN puro.
- ⏱️ El lavado y centrifugación finales aseguran la eliminación de impurezas y la obtención de un precipitado de ADN para su uso o almacenamiento.
- 🔒 El ADN se mantiene estable en el congelador hasta su uso futuro, indicando la importancia de la conservación adecuada para mantener la calidad del material genético.
Q & A
¿Qué es la extracción y purificación del ADN y por qué es importante?
-La extracción y purificación del ADN es el proceso de separar el material genético de las células para su uso en pruebas diagnósticas y estudios. Es importante para obtener resultados exactos y confiables en biología molecular.
¿Cuáles son los principios químicos de separación y purificación utilizados en la extracción del ADN?
-Los principios químicos incluyen la lisis celular, la cual puede realizarse mediante detergentes, como el sodio dodecil sulfato (SDS), y moléculas quelantes como el EDTA, que protegen el ADN de enzimas degradantes.
¿Qué métodos se utilizan para la lisis celular en la extracción de ADN?
-Los métodos para la lisis celular incluyen técnicas químicas, físicas y enzimáticas. Los químicos usan detergentes y quelantes, los físicos pueden involucrar homogeneización mecánica o sonificación, y los enzimáticos utilizan proteasas para romper enlaces peptídicos.
¿Qué es el EDTA y cómo ayuda en la extracción del ADN?
-El EDTA es una molécula quelante que se añade a la solución de extracción para inhibir enzimas que degradan el ADN, como las nucleasas, al unirse a iones magnesio que actúan como cofactors de estas enzimas.
¿Cuál es el propósito de los cloruro de sodio y Tris HCl en la solución de extracción del ADN?
-El cloruro de sodio ayuda a formar una capa iónica que protege el ADN y a precipitar proteínas celulares, mientras que Tris HCl es un buffer que mantiene el pH estable para evitar la degradación del ADN.
¿Cómo se realiza la purificación del ADN después de la extracción?
-La purificación del ADN se realiza eliminando proteínas y lípidos de membrana mediante la adición de solventes orgánicos como el fenol y cloroformo, y luego separando las fases acuosas que contienen el ADN mediante centrifugación.
¿Qué es la precipitación del ADN y cómo se lleva a cabo?
-La precipitación del ADN es el proceso de hacer que el ADN se salga de la solución acuosa para poder recogerlo. Se realiza agregando etanol absoluto, que junto con la sal adicionada en la extracción, promueve la precipitación del ADN, y luego se centrifuga para remover el sobrenadante.
¿Por qué se usa etanol al 7% para lavar el precipitado de ADN?
-El etanol al 7% se usa para lavar el precipitado de ADN para remover sales residuales y otros contaminantes, lo que ayuda a purificar aún más el ADN.
¿Cómo se resuspende el ADN una vez precipitado y seco?
-El botón de ADN seco se resuspende en agua para su uso inmediato o se puede guardar en el congelador. Es importante resuspender el ADN en agua para facilitar su manipulación y análisis en futuros experimentos.
¿Por qué es importante que el ADN se mantenga estable durante el proceso de extracción y purificación?
-Es crucial mantener el ADN estable para evitar su degradación o contaminación, lo que podría afectar negativamente los resultados de las pruebas diagnósticas y estudios moleculares.
Outlines
🧬 Introducción a la extracción y purificación del ADN
Este primer párrafo introduce el tema de la extracción y purificación de ADN, explicando su importancia en pruebas diagnósticas y estudios de biología molecular. Se menciona que la calidad y pureza del ADN son cruciales para obtener resultados precisos y confiables. Se describen los métodos comunes que incluyen procesos químicos, físicos y mecánicos, y se detalla que estos métodos generalmente consisten en tres pasos: extracción, purificación y precipitación. La extracción implica liberar el ADN de la célula mediante lisis, que puede realizarse por métodos químicos, físicos o enzymáticos. Se habla de la utilización de detergentes, como el sodio dodecil sulfato (SDS), para degradar la membrana celular y de la adición de EDTA para inhibir las nucleasas y proteger el ADN. También se menciona el uso de cloruro de sodio para proteger el ADN y precipitar proteínas, y la necesidad de mantener un pH estable con la ayuda de la solución buffer Tris HCl. Se describe el proceso de lisis celular con buffer, que incluye ciclos de incubación y agitación para facilitar la liberación del ADN.
🔬 Proceso de purificación y precipitación del ADN
El segundo párrafo se enfoca en el proceso de purificación y precipitación del ADN después de su extracción. Se explica que la purificación es necesaria para eliminar proteínas y lípidos de membrana, y se detalla el uso de solventes orgánicos como el fenol y el cloroformo para lograr esto. Se describe el proceso de centrifugación para separar las fases acuosa y orgánica, y la importancia de recuperar la fase acuosa que contiene el ADN. Además, se menciona la precipitación del ADN con etanol, que también ayuda a remover sales residuales. Se detalla el proceso de lavado del precipitado de ADN con etanol al 7% para eliminar sales restantes y se indica que el ADN se puede resuspender en agua o guardar en el congelador hasta su uso. El párrafo concluye con la mención de que el ADN es estable por varios días si se mantiene a una temperatura constante.
Mindmap
Keywords
💡Extracción de ADN
💡Purificación de ADN
💡Lisis celular
💡Detergentes
💡EDTA
💡Cloruro de sodio
💡Tris HCl
💡Fenol
💡Cloruro de potasio
💡Etanol
Highlights
Extracción y purificación del ADN es fundamental para su uso en pruebas diagnósticas y estudios de biología molecular.
La calidad y pureza del ADN son cruciales para obtener resultados exactos y confiables.
Existen varios métodos de extracción y purificación del ADN, y se debe elegir el más adecuado según las necesidades.
La extracción del ADN implica sacarlo del compartimiento celular mediante una lisis.
La lisis celular se puede realizar mediante métodos químicos, físicos o enzimáticos.
Los métodos químicos utilizan detergentes y moléculas quelantes para degradar la membrana celular y proteger el ADN.
La incubación y agitación facilitan la ruptura de los lípidos de la membrana celular y la liberación del ADN.
Los métodos físicos incluyen homogeneización mecánica, molienda manual o sonificación para liberar el ADN.
Los métodos enzimáticos utilizan proteasas para romper enlaces peptídicos y liberar el ADN.
La purificación del ADN se realiza con la eliminación de proteínas y lípidos de membrana.
Se agregan solventes orgánicos como el fenol para separar el ADN de otros componentes celulares.
La centrifugación permite la formación de dos fases y la recuperación del ADN en la fase acuosa.
El cloroformo se utiliza para eliminar residuos lipídicos que puedan estar presentes en la muestra.
La precipitación del ADN se lleva a cabo con la adición de etanol absoluto.
El etanol también ayuda a remover la concentración residual de sales.
El precipitado de ADN se lava con etanol al 7% para remover sales y se seca a temperatura ambiente.
El ADN seco puede resuspenderse en agua para su uso o guardarse en el congelador.
El ADN es estable por varios días conservado a una temperatura estable.
Transcripts
Bienvenidos en esta cápsula hablaremos
sobre la extracción y la purificación
del ADN en ella entenderemos los
principios químicos de separación y
purificación describiremos las
generalidades de los diversos mecanismos
de extracción y lo más importante
comprender la necesidad de la extracción
de ADN para su uso en pruebas
diagnósticas el ADN como se había
comentado con anterioridad es es Útil
para la realización de diversos estudios
diagnósticos utilizando pruebas de
biología molecular para poder realizar
dichas pruebas es necesario iniciar con
la extracción y purificación y así
obtenerlo de diferentes Fuentes con un
alto grado de calidad y pureza de esta
forma los resultados serán más exactos y
confiables existe una gran variedad de
métodos por lo que debe elegirse el que
más se adecúe a nuestras necesidades los
comúnmente empleados combinan procesos
químicos físicos y o mecánicos e
incluyen básicamente tres pasos que son
primero una extracción la cual implica
sacar el ADN del compartimiento celular
por medio de una lisis el segundo sería
una purificación esta permite separar el
ADN de los demás componentes celulares Y
por último una precipitación que es en
la cual ya tendríamos el ADN
completamente puro como se mencionó El
Paso inicial de cualquier método es la
extracción como el material genético se
encuentra dentro de la célula lo primero
es realizar una Lis la lisis permite
liberar el ADN el interior y puede
realizarse por métodos químicos métodos
físicos o métodos
enzimáticos primero hablaremos de la
lisis celular generada por métodos
químicos estos utilizan buffers de
extracción que contienen detergentes
como el sodio do decilo
disulfides DS este degrada la membrana
celular capturando lípidos y proteínas
evitando que cantidades significativas
de ADN queden atrapadas en los restos
celular
también se le debe Añadir a la solución
moléculas quelantes Como por ejemplo el
edta que posee cuatro grupos carboxilo y
dos grupos amino y cuya forma totalmente
desprotonada Puede unirse a iones
magnesio el magnesio funciona como un
cofactor de las enzimas que degradan el
ADN o sea las nucleasas por lo tanto al
agregarle el edta estas son inhibidas
protegiendo así el
ADN algunas sales como el cloruro de
sodio forman una capa iónica suave que
recubre la ADN y así lo protegen y
ayudan a evitar su degradación además de
deshidratar y precipitar proteínas
celulares estas soluciones también deben
contener Tris hcl que es una solución
buffer que mantiene el pH de la solución
estable aproximadamente entre 7.5 y
8.2 algunas contienen también proteínas
K que permiten degradar proteínas o
enzimas Y de esa forma ayudan a
purificar cada vez más el ADN durante la
lisis con bofer la muestra es sometida a
tres o cuatro ciclos de incubación a
temperaturas entre los 50 y 70 gr C
alternados con agitación de la muestra e
incubación a 4 gr c estas incubaciones
también facilitan la ruptura de los
lípidos de la membrana celular
permitiendo la liberación del ADN de la
estructura como habíamos mencionado la
lisis celular también podía realizarse
por métodos físicos esta se realiza con
homogeneización mecánica o en solución
moliendo manualmente en un mortero o por
sonifica estos métodos también pueden
ser usados cuando es necesaria la
disgregación o fragmentación de algún
tejido antes de realizar la lisis con
las soluciones buffer por último la
extracción puede hacerse por métodos
enzimáticos estos métodos utilizan
proteasas que rompen los enlaces
peptídicos de proteínas de la pared y
membrana plasmática además de las
interacciones célula a célula el
resultado es uná lisis celular que
libera el material genético a la
solución
como se comentó al inicio el mejor
método es el que se adapta a las
necesidades de la muestra y a las
necesidades que tenga el
laboratorio luego de extraído El ADN de
la célula por cualquiera de los métodos
antes descritos es necesario realizar
una purificación esta se realiza con la
eliminación de proteínas y lípidos de
membrana la eliminación de estos se
realiza agregando solventes orgánicos
Como por ejemplo el fenol que debe
agregarse en un volumen igual al de la
muestra debe de agitarse hasta que que
la solución dentro del tubo tenga un
aspecto de emulsión y posteriormente
debe centrifugar la centrifugación
permite la formación de dos fases una
acuosa y otra orgánica y entre ellas se
forma una interface que es en donde
quedan atrapadas proteínas de membrana y
las nucleasas liberadas durante la lisis
celular la fase acuosa es la que
contiene el ADN por lo tanto es la que
nos interesa recuperar Así que debe
traspasarse a otro tubo estéril siempre
teniendo el cuidado de no arrastrar la
interface o la fase orgánica
Posteriormente se agrega cloroformo en
un volumen igual al del sobrenadante
recuperado y se procede de la misma
manera que con el fenol en este paso son
eliminados residuos lipídicos que
pudiesen estar aún presentes en la
muestra nuevamente la fase acuosa
conteniendo el ADN debe recuperarse en
otro tubo estéril por último es
necesario precipitar el ADN esta
precipitación se lleva a cabo agregando
etanol absoluto a la fase acuosa
recuperada la sala adicionada en el
bofer de extracción también ayuda la
precipitación del ADN debido a la
formación de una capa iónica positiva
alrededor de este como se había
mencionado con anterioridad el etanol
además cumple la función de remover la
concentración residual de sales luego se
centrifuga para remover el sobrenadante
recordar que el ADN ha precipitado y
ahora es este precipitado el que nos
interesa al descartar el sobrenadante el
botón del precipitado de ADN se lava con
etanol al 7 % el objetivo de este lavado
es remover todas las ales que aún estén
presentes nuevamente se centrifuga y se
elimina todo el etanol dejando secar el
botón de ADN por media hora a
temperatura ambiente es importante que
sea en un lugar protegido hasta que todo
el etanol se haya evaporado una vez seco
el botón de ADN puede resuspend perse en
agua para ser utilizado o bien puede
guardarse En el congelador hasta su uso
el ADN es estable por varios días
conservado a una temperatura estable con
esto hemos terminado la extracción y la
purificación de una muestra de ADN que
ahora puede ser sometida a investigación
para algún uso diagnóstico con algún
método posterior
[Música]
gracias
ah
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