Praktikum Biokimia Farmasi : Penentuan Aktivitas Spesifik Enzim
Summary
TLDRThis script discusses the laboratory practice of determining specific enzyme activities, focusing on glutathione S-transferase (GST). It covers the preparation of liver cytosolic fractions from rats, the measurement of enzyme activity using CDNB as a substrate, and protein concentration using the Biuret method. The script also explains the importance of measuring enzyme activity and protein concentration in pharmacology, particularly in the context of detoxification and the potential targeting of GST in cancer therapy.
Takeaways
- 🔬 The lab session focuses on determining the specific activity of the enzyme Glutathione S-Transferase (GST) and measuring protein concentration using the Biuret method.
- 🧬 Proteins are polymers made up of amino acids as monomers, with 20 different types of amino acids that can be polar, nonpolar, charged, or uncharged.
- 📚 Quantitative analysis of proteins can be done through various methods including titration, spectrophotometry, and biuret reaction which is highlighted in the script.
- 🌡 The Biuret method involves the reaction of peptide chains with the biuret reagent, resulting in a purple complex that can be measured at a wavelength of 560 nanometers.
- 📉 The Biuret method has its advantages such as being quick and simple, but also has limitations like low sensitivity due to not all protein groups reacting positively.
- 🛠 GST is an enzyme involved in phase 2 metabolism, conjugating glutathione with various substrates, including xenobiotics, which can be detoxified in the body.
- 🐀 The lab procedure involves preparing a cytosolic fraction containing GST from rat liver, which is then used to determine enzyme activity using CDNB as a substrate.
- 📊 A standard curve using BSA (Bovine Serum Albumin) is created to measure protein concentration in the cytosolic fraction using the Biuret method.
- ⚗️ The specific activity of the enzyme is calculated by dividing the reaction rate (micromoles of product per minute) by the protein concentration in the cytosolic solution (milligrams per milliliter).
- 💊 GST's role in detoxification is significant in the field of pharmacology, especially as it can be a target for therapy in cancer treatment by enhancing the effectiveness of chemotherapy drugs.
- 📝 The importance of measuring enzyme specific activity is emphasized, particularly in the context of pharmaceutical research, where GST's activity can indicate the purity and effectiveness of the enzyme in detoxifying processes.
Q & A
What is the main objective of the lab practice described in the transcript?
-The main objective of the lab practice is to determine the specific activity of the enzyme Glutathione S-Transferase (GST), establish the protein concentration using the biuret method, and understand the concept of enzyme activity in relation to the amount of protein used in the reaction.
What is the significance of determining the specific activity of the enzyme GST?
-Determining the specific activity of GST is important because it provides a measure of the enzyme's efficiency and purity. It indicates how much substrate is converted to product per unit time and per unit amount of enzyme protein.
What is the biuret method used for in this context?
-The biuret method is used to determine the protein concentration in the supernatant fraction of the cell lysate. It is a colorimetric assay that measures the absorbance of a complex formed between copper ions and peptide bonds in proteins.
What are the different types of amino acids that make up proteins?
-Proteins are made up of 20 different types of amino acids, which can be categorized based on their side chains as nonpolar, polar uncharged, and polar charged.
How does the biuret reagent react with proteins to indicate a positive result?
-The biuret reagent reacts with peptide bonds in proteins to form a complex that absorbs light in the visible spectrum, resulting in a color change to a blue-purple hue, indicating the presence of protein.
What is the role of GST in phase 2 metabolism?
-GST plays a crucial role in phase 2 metabolism by catalyzing the conjugation of glutathione with various substrates, including xenobiotics, which helps in the detoxification process and the elimination of these substances from the body.
How is the enzyme activity measured in the lab practice?
-The enzyme activity is measured by monitoring the formation of the product, in this case, the GS-DNB conjugate, spectrophotometrically at 346 nm over time, which allows for the calculation of the reaction rate and enzyme activity.
What is the significance of measuring the protein concentration in the supernatant fraction?
-Measuring the protein concentration in the supernatant fraction is essential for calculating the specific activity of the enzyme. It ensures that the enzyme activity is normalized to the amount of protein present, providing a more accurate representation of the enzyme's efficiency.
What is the purpose of creating a standard curve using BSA in the biuret method?
-The purpose of creating a standard curve using BSA is to establish a relationship between the absorbance values and known concentrations of protein. This curve is then used to determine the unknown protein concentration in the supernatant fraction.
Why is it important to know the specific activity of an enzyme in pharmaceutical research?
-Knowing the specific activity of an enzyme like GST is important in pharmaceutical research because it can help in understanding the enzyme's role in drug metabolism and detoxification, which is crucial for developing drugs and therapies, especially in cancer treatment.
Outlines
🔬 Enzyme Activity and Protein Concentration Determination
This paragraph introduces the objectives of a laboratory practice focused on determining the specific activity of the enzyme Glutathione S-Transferase (GST) and the protein concentration using the biuret method. It explains the importance of knowing the protein concentration in the reaction mixture for accurate enzyme activity measurements. The paragraph also delves into a brief overview of proteins, their structure, and the different types of amino acids that compose them. It outlines various quantitative protein analysis methods, including titration, gasometry, and spectrophotometry, highlighting the biuret method's advantages and limitations.
🧪 Preparation and Analysis of Glutathione S-Transferase
The second paragraph details the process of preparing a cytosolic fraction containing glutathione transferase from mice, which is then verified using LED. It describes the steps for determining enzyme activity in the liver of mice using the CDN method and creating a standard curve with BSA using the biuret method. The paragraph also explains the process of isolating cytosol, including the use of centrifugation and specific buffers, and storing the reaction mixture for further laboratory practice. It emphasizes the importance of measuring protein concentration and enzyme activity in the context of studying GST, a phase 2 metabolism enzyme involved in the detoxification process.
📊 Measuring Enzyme Activity and Creating a Standard Curve
This paragraph discusses the methodology for measuring the activity of GST using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene as a substrate and recording the absorbance at 346 nm to determine the enzyme's activity in micromoles per minute per millimeter. It also explains how to create a standard curve using BSA and the biuret reagent, which involves mixing reagents, observing the reaction, and measuring absorbance at 550 nm. The paragraph provides a formula for calculating the protein concentration in the cytosolic fraction and emphasizes the importance of accounting for dilution factors in the calculations.
🏥 Significance of Specific Enzyme Activity in Pharmacology
The final paragraph explores the significance of measuring specific enzyme activity, particularly for GST, in the field of pharmacology. It discusses the role of GST as a phase 2 metabolism enzyme that catalyzes the conjugation of glutathione with various substrates, including xenobiotics. The paragraph highlights the potential of GST as a therapeutic target in anti-tumor agents, given its overexpression in tumors and its ability to detoxify chemotherapy drugs. Targeting GST could enhance the effectiveness of chemotherapy by reducing its detoxification, leading to a more aggressive treatment against cancerous cells.
Mindmap
Keywords
💡Specific Activity of Enzyme
💡Glutathione S-Transferase (GST)
💡Biuret Method
💡Cytosolic Fraction
💡Enzyme Activity Assay
💡Protein Concentration
💡Spectrophotometry
💡Protein Polymerization
💡Amino Acids
💡Electrophilic Compounds
💡Conjugation Reaction
Highlights
The purpose of the lab is to determine the specific activity of the enzyme Glutathione S-Transferase (GST) and the protein concentration using the biuret method.
Proteins are polymers made up of amino acids as monomers, with 20 different types involved in their structure.
Amino acids consist of an amino group and a carboxyl group, with side chains that can be nonpolar, polar uncharged, or polar charged.
Quantitative protein analysis methods include volumetry, gasometry, and spectrophotometry, each with its principles and applications.
The biuret method involves the reaction of peptide chains with the biuret reagent, resulting in a purple complex measurable at a wavelength of 560 nanometers.
The biuret method's advantages include its speed and simplicity, but it is less sensitive due to not all protein groups reacting positively.
GST is a phase 2 metabolism enzyme that catalyzes the conjugation of glutathione with various substrates, including xenobiotics.
GST plays a role in the detoxification process, converting electrophilic compounds into more reactive forms that can be conjugated with glutathione.
The lab procedure includes the preparation of cytosolic fractions containing GST from mice, which will be confirmed by LED.
The determination of GST enzyme activity is performed using the CDNB method, measuring the formation of the GS-DNB conjugate at 346 nm.
A standard curve of BSA with the biuret method is created to determine protein concentration in the cytosolic fraction.
The calculation of specific enzyme activity involves dividing the reaction rate by the protein concentration in the cytosolic solution.
The importance of measuring protein concentration and enzyme activity is highlighted, especially in the context of pharmacology and detoxification.
GST's role in protecting cells from chemotherapy-induced cell death and its potential as a therapeutic target in cancer treatment is discussed.
The lab concludes with the significance of GST in pharmacology, its relevance in anti-tumor agents targeting, and its potential impact on cancer therapy.
Transcripts
02.00 room yang akan kita bahas paginya
adalah penentuan aktivitas spesifik
enzim Kapan tujuan dari praktikum adalah
menetapkan nilai Aktivitas enzim GST
yang kedua adalah menetapkan nilai kadar
protein menggunakan metode biuret
kemudian yang ketiga adalah menentukan
aktivitas spesifik enzim GST sebagai
dasar bahwa Aktivitas enzim PST dalam
suatu campuran protein tergantung dari
jumlah protein yang digunakan dalam
reaksi tersebut oleh karena itu perlu
diketahui kadar protein dalam volume
yang ditambahkan
Ayo kita flashback mengenai protein 1140
Tein merupakan polimer yang tersusun
atas asam amino sebagai monomer yang
mana ada 20 jenis asam amino yang
menyusun protein asam amino terdiri atas
beberapa atau mitos bahwa atom ada gugus
amino dan gugus karboksil dimana rantai
samping itu bisa berupa gugus yang
nonpolar polar tidak bermuatan bisa juga
polar yang bermuatan
cce asam amino bisa berpolimerisasi
membentuk rantai linier atau rantai
polipeptida yang digabungkan Oleh ikatan
peptida nah Bagaimanakah cara kita
menganalisis protein secara kuantitatif
dari beberapa metode volumetri misalnya
adalah metode girl dengan dan cepatlah
penetapan nitrogen total kemudian
titrasi formol ini menggunakan
formaldehid untuk meletus gugus Amin
kemudian dilakukan titrasi alkalimetri
metode yang lain adalah gasometri yaitu
dengan cara mengubah Gus Amin menjadi
gas nitrogen sudah ditetapkan berapa gas
nitrogen yang dihasilkan
Hai yang ketiga adalah spektrofotometri
baik Juve maupun Sinar tampak Yini
prinsipnya adalah adanya asam amino yang
memiliki khusus aromatik misalnya adalah
fenilalanin tirosin dan triptofan
kemudian spectrophilia simpel misalnya
adalah direaksikan dengan reagen biuret
fehling dan juga laurie dalam waktu ini
kita menggunakan spektrofotometri Sinar
tampak dengan metode biuret yaitu
pengukuran serapan warna biru ungu dari
Kompleks pu dan juga protein yang bisa
terukur pada panjang gelombang 560
nanometer jadi Anda lihat disini adalah
rantai peptida direaksikan dengan reagen
biuret yang mengandung ion CO2 +
Hai ini akan membentuk kompleks seperti
ini yang mana Kompleks ini akan berwarna
Hai biru ungu versi beratnya memberikan
Taqwa reaksi positif pada
senyawa-senyawa yang mengandung gugus
seperti ini ada diganggu jernih bisa
bereaksi positif metode ini cepat dan
sederhana namun kurang sensitif Mengapa
Karena semua grup tidaknya proteinnya
temen semua molekul yang memiliki gugus
seperti ini dia akan bereaksi positif
keuntungan dan kelemahan untuk dikuret
jadi keuntungan sebagai dengan kadar
protein itu ikatan polipeptida nya itu
akan semakin banyak ketemu lebih dalam
maka kadar proteinnya semakin tinggi
kemudian kelemahannya adalah kurang peka
Oh ya karena itu tadi Kalau punya gugus
dengan tiga tadi dia bisa reaksi positif
muda stabilitas warnanya ini juga akan
berpengaruh Mengapa sih kita harus
mengukur konsentrasi protein dan mengapa
kita harus mengukur Aktivitas enzim yang
akan kita ukur pada waktunya adalah GST
glutathion es transferase i
xsara enzim pemetabolisme fase2 ya kalau
S1 adalah untuk
b**** reduksi-oksidasi membuat segera to
obat pertama yang menjadi ritual
sementara yang disini adalah untuk
meningkatkan kemampuan ekskresi dari
obat dari dalam tubuh kita
cerita balik kesini GST adalah
glutathion es transferase merek kofaktor
adalah glutathion education ini nanti
akan bereaksi dengan xenobiotik misalnya
ya di sini oleh enzim DST maka
glutathion ini akan ditransfer
direaksikan dengan xenobiotik sehingga
menghasilkan ini konjugat obat yang
kwitansi dengan gluthatione
Ndah konjugasi glutathion ini melibatkan
senyawa senyawa xenobiotik atau
senyawa-senyawa obat yang elektrofil
atau yang di
Hai biotransformasi menjadi senyawa
biogeografi senyawa xenobiotik yang
elektrofil tadi yang ada dua ya yang
elektrofil maupun yang harus diwujudkan
ser masih belum jadi senyawa yang
elektrofil
t-shirt substratnya ini ada yang satu
adalah substrat hidrofob substrat
elektrofil dan substrat yang reaksi
secara non enzimatik dengan glutation
ngomonge kita langsung saja ke slide
berikutnya jadi dan juga sih langsung
dengan cara displacement pada gugus
benar elektron jadi misalnya disini
adalah 12 dikloro nitrobenzen ini CL nya
keluar digantikan oleh
stationeries kemudian ada 4-nitrophenol
in ya gps-nya menggantikan
mno2 disini kemudian ada daerah
conjugation baik edition dan tradisi di
sini ya Ra tradisi disini jadi ikatan
rangkap dua nyilang jadi seperti
Hai ketan tunggal ada konjugasi ketua
tim Disini yang ketiga adalah konjugasi
oval strain ring sistem jadi disini
misalnya senyawa ini eh eh
Hai harus ditransformasi dulu menjadi
yang sinyal yang lebih reaktif menjadi
exit disini kemudian baru bisa
diprediksikan dengan gluthatione
kweni kelasnya macam-macam ada stigma
al-fathimy Teta tahu dan sebagainya
drag strategi ST Ini pertama kali
dipublikasikan pada tahun 1994 termasuk
CD NB yang Anda gunakan saat praktikum
cara kerja yang kita lakukan ada lima
Yang pertama adalah penyiapan fraksi
sitosol mengandung glutathion
transferase dari tikus ini akan disahkan
oleh LED yang kedua adalah penentuan
Aktivitas enzim yang mana merupakan
enzim GST pada liver tikus dengan metode
cdn
Hai kemudian pembuatan kurva baku
Hai BSA dengan metode biuret yang
keempat telah penetapan kadar protein
fraksi sitosol menggunakan metode biuret
Hai Ingatlah penghitungan aktivitas
spesifik enzim untuk penyiapan fraksi
sitosol yang mengandung DST dari tikus
ini diambil dari tikus jantan
Hai diberi pelet tipe makan pelet dan
air minum seperlunya kemudian
Hai setelah rapper laku anak selesai
jadi kita bisa misalnya memperlakukan
tikus ini dengan berbagai macam
perlakuan tambah obat tertentu ataupun
atau misalnya kalau tidak ya tanpa
perlakuan kemudian tikus dipuasakan
selama 24 jam dikorbankan dengan
dislokasi leher hebatnya diambil
kmudian Kak sitosol ini di isolasi
dengan metode sentrifugasi bertingkat
tentu saja setelah hebat diambil hal-hal
Rusdi masukkan gelap fosfat Nose dingin
dengan pH 7 setengah dengan konsentrasi
0,1 molar dan hepatikus ini dihancurkan
menggunakan blender
Hai sama terlebih lima menit
kmungkinan halus disentrifugasi dengan
kecepatan 10000q selama 30 menit pada
suhu 4° supermatte diambil lalu
dipindahkan ke tabung baru depannya
dibuang lalu kemudian super matanya
disentrifugasi lagi dengan kekuatan yang
lebih tinggi lagi 105g selama 90 menit
pada suhu 4° super matanya yang
merupakan fraksi sitosol ini diambil
kemudian reaksi total tersebut disimpan
pada suhu minus 80° celcius sampai saat
akan digunakan untuk praktikum yang
kedua
ini adalah penentuan Aktivitas enzim GST
dengan metode cd-rw atau 1-kloro 24
dinitrobenzene kita ambil fraksi sitosol
40 militer ataupun aquades kalau ini
sebagai blanko ya tambahkan fosfat PH 6
Desa dan CD NB ini total volumenya
adalah satu milih Kalau Anda menggunakan
kuvet yang satu mili maka formulanya ini
kalau menggunakan konsep yang tidak
milih maka ini dikalikan tiga kali
Oke telah dimasukkan reagennya produk
konjugat GS dnb yang terbentuk diukur
pada lamda 346 meter dari menit ke-60
sampai pun ketika menggunakan
spektrofotometer
sesuai dengan program simple kinetik
Hai nah hasilnya berupa Delta serapan
permenit yang selanjutnya diukur
aktivitas GST dalam satuan mikromol
produk per menit
ksatria kecepatan reaksi atau Delta
absorbansi per menit berapa kemudian
dilakukan perhitungan ya bahwa ekstensi
mulai dari GNP adalah 8500 per micromist
4 cm sehingga aktivitas GST adalah
kecepatan reaksi yang menepi ini dibagi
dengan 8500 sehingga aktivitas GST
adalah
Hai ini disini nilainya B dibagi 8500
satunya adalah micromist qnp per menit
syair kegiatan yang ketiga adalah
membuat kurva baku BSA dengan metode
biuret reagen biuret isinya apa saja ada
CuSO4 kalium tartrat aquades
g-star juga
ndak dewa untuk membuat kurva baku maka
anda mengambil
Hai albumin
Hai saya admin stok yang telah disiapkan
di lab dengan volume petani sebagai
berikut jangan lupa disiapkan blanko
kemudian ambil buffer fosfat dan juga
tragedi uret nah formal disini adalah
formula untuk
Hai total volume adalah satu milih
Hai Kalau Anda menggunakan volume ufe3
mi5 kini dikalikan-3 jadi setelah reagen
dicampur diamkan 10 menit diamati
serapannya pada 550 m Anda diminta untuk
membuat kurva baku antara absorbansi
versus
b**** ya singa ketemu persamaan kurva
baku
Indonesia harus perhatikan adalah faktor
pengenceran yang terjadi apabila anda
melakukan pengendara
Ya udahlah ketemu kenapa aku makan nanti
anda kegiatan selanjutnya telah
menetapkan kadar protein reaksi total
dengan metode biuret Jadi praktis
sitosol diambil saat micro
hai eh ditambahkan bahwa dan juga reagen
biuret diamkan lima menit ukur
serapannya ketemu absorbansinya
lelaki ini adalah volumenya total atau
milih Kalau Anda menggunakan kosmetika
mi5 kami dikalikan-3 setelah didiamkan
ya ya
Hai setelah campuran didiamkan maka
serapan dibaca pada lamda 550
Hai ketemulah absorbansi
I dari Fraksi stelsel tersebut kemudian
dimasukkan ke persamaan kurva baku nanti
anda bisa menentukan kadar protein yang
terdapat pada fraksi sitosol tadikan
Anda mengambilnya 40 L aksi testos itu
soalnya Sehingga dalam 40 mikroliter
tadi berapa mg protein yang dihasilkan
ini telah yang nilai edisi ini dan
catatan yang harus diperhatikan bahwa
apabila anda melakukan pengenceran maka
kadarnya ini harus dikalikan dengan
faktor pengenceran yang Anda lakukan
I make Nah tadi pertama Anda mendapatkan
Aktivitas enzim dengan satuan mikromol
Yes dan beberapa menit kemudian Anda
mendapatkan data lagi yaitu jumlah
protein dalam fraksi sitosol yang
diambil misalnya adalah mengambil 40
mikroliter atau senilai
kmudian kadar protein dalam retensi
total nanti
Hai konversi dalam satuan miligram per
ML aktivitas spesifik DST adalah nilai
ini Grace ya berapa mikromol GNP per
menit dibagi dengan kadar protein
larutan sitosol dalam satuan miligram
per ML sehingga aktivitas spesifik enzim
satuannya telah micromist guess dnb per
menit per MG protein
kekeke pakai catatan satu unit atau Un
gym adalah Jumlah enzim yang
mengkatalisis reaksi satu mikromol
substrat per menit pada kondisi standar
kemudian aktivitas spesifik Enzim adalah
Jumlah unit enzim per ML dibagi dengan
konsentrasi protein dalam MG per ML atau
jumlah n jumlah unit enzim per MG
protein sehingga satuan aktivitas
spesifik Enzim adalah unit per mg
Indonesia tataraning ketiga kemudian
enzim ini sebanding dengan nilai
aktivitas spesifiknya artinya semakin
besar nilai aktivitas spesifik maka
semakin tinggi pula kemurniaan enzim
tersebut
Hai ada pertanyaan mengapa kita mengukur
aktivitas
spesifikasi gym hubungi dengan bidang
kita adalah bidang Farmasi sebagai
contoh di sini ada satu artikel ilmiah
Advance in anti tumor agen targeting jst
kali disini bahwa GST merupakan enzim
pemetabolisme fase 2 yang mengkatalisis
konjugasi glutathion dengan berbagai
macam substrat kok tadi disebutkan
xenobiotik maka disini contohnya adalah
Hai agen kemoterapi atau kemoterapi
kwini terlibat pada
Hai proteksi sel terhadap induksi
kematian sel akibat penggunaan ini
kemoterapi
Indonesia karena GST ini biasanya adalah
Hai diekspresikan atau jumlahnya
berlebih pada eh tumor ganas maka GST
ini
ia bisa menjadi target terapi Mengapa ya
karena ternyata di KFCnya ini jumlahnya
berlebihan sementara GST ini juga dia
mendetoksifikasi kemoterapi sehingga
kemoterapi menjadi efektif karena dia di
detoksifikasi oleh GSC pada tumbuhan
yang ganas hingga kalau kita lakukan
targeting GST dengan obat tertentu maka
destence Roger agresi ini jumlahnya
rendah akibatnya apa maka kemoterapi nya
bisa membunuh sel tumor ganas
demikian yang bisa kita sampaikan
selamat bekerja selamat pagi dan terima
kasih
5.0 / 5 (0 votes)