Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - Biochemie - Labormethoden - AMBOSS Video

AMBOSS DE

12 Oct 201605:31

Summary

TLDRDie Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine molekularbiologische Methode zur Vervielfältigung von DNA-Abschnitten. Sie basiert auf der zellulären DNA-Replikation, wird aber in vitro durchgeführt. Durch den Einsatz von DNA-Polymerase und Primern, die die zu verlängernden DNA-Stränge angeben, werden spezifische DNA-Stücke exponentiell vervielfältigt. Die Prozessschritte beinhalten Denaturierung, Annealing und Elongation, die in mehreren Zyklen wiederholt werden. Die resultierende amplifizierte DNA kann für Analysen oder Anwendungen wie die Herstellung von therapeutischen Proteinen verwendet werden.

Takeaways

🔬 Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung bestimmter DNA-Abschnitte.
🌡️ PCR basiert auf den Mechanismen der zellulären DNA-Replikation und wird in vitro durchgeführt.
🔄 Die doppelsträngige DNA wird durch Hitze getrennt und anschließend mit Hilfe von DNA-Polymerase neu synthetisiert.
📈 Die Vervielfältigung erfolgt exponentiell durch wiederholte Reaktionszyklen.
🌡️ Die Temperaturzyklen bestehen aus Denaturierung (90°C), Annealing (50-60°C) und Elongation (70°C).
🧬 Die Reaktion benötigt Ausgangs-DNA, Nukleotide, eine hitzestabile DNA-Polymerase und zwei Primer.
🔬 Hitzestabile DNA-Polymerasen, wie die Taq-Polymerase, bleiben nach Erhitzung auf hohe Temperaturen funktionsfähig.
🔬 Primer sind kurze Oligonukleotide, die als Anknüpfungspunkte für die DNA-Polymerase dienen.
📈 Nach jedem Zyklus verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Moleküle, die dem gewünschten Abschnitt entsprechen.
🧫 Nach ca. 30 Zyklen kann das DNA-Fragment um den Faktor 10^6 bis 10^12 amplifiziert werden.
🔎 Die amplifizierte DNA kann mittels Gelelektrophorese analysiert und zur Detektion von Erreger-DNA verwendet werden.
🛠️ PCR wird auch für die Herstellung therapeutisch eingesetzter Proteine, wie rekombinantes Humaninsulin, genutzt.

Q & A

Was ist die Polymerasekettenreaktion (PCR)?
-Die Polymerasekettenreaktion, kurz PCR, ist eine Standardmethode der Molekularbiologie zur Vervielfaeltigung bestimmter Abschnitte doppelstraengiger DNA in vitro.
Wie basiert das Grundprinzip der PCR?
-Das Grundprinzip der PCR basiert auf den Mechanismen der zellulaeren DNA-Replikation, wobei die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufgespalten und anschließend von einer DNA-Polymerase neu synthetisiert wird.
Was ist das Ziel der PCR?
-Das Ziel der PCR ist es, einen spezifisch festgelegten DNA-Abschnitt exponentiell zu vervielfältigen, also zu amplifizieren.
Welche Rolle spielen die Primer in der PCR?
-Die Primer sind kurze Oligonukleotide, die als Anknüpfungspunkte für die DNA-Polymerase dienen und den zu amplifizierenden DNA-Abschnitt in beide Richtungen begrenzen.
Welche Art von DNA-Polymerase wird in der PCR verwendet?
-In der PCR wird eine hitzestabile DNA-Polymerase verwendet, wie zum Beispiel die Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus, die auch nach Erhitzung auf hohe Temperaturen noch funktionstüchtig ist.
Was geschieht in der Denaturierungsphase der PCR?
-In der Denaturierungsphase wird die Temperatur auf 90°C erhöht, was dazu führt, dass die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufspaltet.
Was ist die Annealing-Temperatur und welche Rolle spielt sie?
-Die Annealing-Temperatur liegt zwischen 50-60°C und ist die Temperatur, bei der die Primer sequenzspezifisch an die komplementären DNA-Sequenzen anlagern können.
Was passiert in der Elongationsphase der PCR?
-In der Elongationsphase wird die Temperatur auf etwa 70°C erhöht, die optimale Arbeitstemperatur der DNA-Polymerase, um die Nukleotide an die Primer anzuhängen und den neuen DNA-Strang zu synthetisieren.
Wie viele Nukleotide sind im Reaktionsansatz der PCR enthalten?
-Im Reaktionsansatz der PCR sind vier verschiedene Nukleotide enthalten: Desoxyadenosintriphosphat, Desoxyguanosintrisphosphat, Desoxycytidintriphosphat und Desoxythymidintriphosphat.
Was kann man mit der amplifizierten DNA nach der PCR machen?
-Die amplifizierte DNA kann in einer Gelelektrophorese visualisiert, weiter analysiert oder in ein Bakteriengenom transferiert werden, um beispielsweise therapeutisch eingesetzte Proteine herzustellen.
Was ist die Bedeutung der hohen Spezifität in der PCR?
-Die hohe Spezifität der PCR ermöglicht die Nachweisbarkeit auch von schwer oder gar nicht kultivierbaren Mikroorganismen und erhöht die Genauigkeit der Erkennung und Identifizierung von DNA-Abschnitten.

Outlines

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🔬 PCR-Definition und Grundprinzip

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine molekularbiologische Methode zur Exponentiellen Vervielfältigung von DNA-Abschnitten. Sie basiert auf der zellulären DNA-Replikation, jedoch in vitro durchgeführt. Die doppelsträngige DNA wird durch Hitze getrennt, und DNA-Polymerase synthetisiert neue Tochterstränge. Die Vervielfältigung erfolgt durch Wiederholung dieser Prozesse, wobei sehr geringe Mengen an Ausgangs-DNA ausreichen, da die Reaktion hoch spezifisch ist und stark vervielfacht wird.

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🧬 Detaillierter Ablauf der PCR-Reaktion

Der PCR-Reaktionsablauf beginnt mit der Aufnahme von Ausgangs-DNA, Nukleotiden, einer hitzestabilen DNA-Polymerase wie der Taq-Polymerase und zwei Primern. Die Reaktion umfasst mehrere Zyklen, die aus der Denaturierung der DNA bei 90°C, dem Annealing der Primer bei 50-60°C und der Elongation bei ca. 70°C bestehen. Jeder Zyklus verdoppelt die DNA-Menge, wobei die Anzahl der ursprünglichen langen DNA-Moleküle im Verhältnis zu den gewünschten Produkten gering bleibt, da diese exponentiell wachsen.

🌟 Anwendung und Analyse der amplifizierten DNA

Die durch PCR amplifizierte DNA kann für verschiedene Analysen verwendet werden, wie die Identifizierung von Erreger-DNA mittels Gelelektrophorese. Die hohe Spezifität der PCR erlaubt die Nachweisbarkeit von Mikroorganismen, die schwer oder nicht kultivierbar sind. Darüber hinaus kann die DNA auch in ein Bakteriengenom transferiert werden, um therapeutisch eingesetzte Proteine wie rekombinantes Humaninsulin herzustellen.

Mindmap

Keywords

💡Polymerasekettenreaktion

Die Polymerasekettenreaktion, abgekürzt PCR, ist eine Methode der Molekularbiologie, die zur Vervielfältigung von bestimmten Abschnitten der doppelsträngigen DNA verwendet wird. Sie ist das Hauptthema des Videos und erklärt, wie DNA in vitro exponentiell vervielfältigt werden kann. Im Skript wird sie als Standardmethode beschrieben, die auf den Mechanismen der zellulären DNA-Replikation basiert, jedoch außerhalb der Zelle durchgeführt wird.

💡DNA-Replikation

DNA-Replikation ist der Prozess, bei dem eine Zelle eine Kopie ihres Erbguts herstellt, um vor der Zellteilung aufgenommen zu werden. Im Kontext des Videos beruht die PCR auf diesen Mechanismen, um die DNA-Vervielfältigung in vitro durchzuführen. Die PCR nutzt die Eigenschaften der DNA-Polymerase, um die DNA-Kette zu kopieren und zu verlängern.

💡DNA-Polymerase

DNA-Polymerase ist ein Enzym, das bei der DNA-Synthese und -Replikation eine zentrale Rolle spielt. Im Video wird die hitzestabile DNA-Polymerase, wie die Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus, hervorgehoben, weil sie nach Erhitzung noch aktiv bleibt und die DNA-Kette an der richtigen Stelle verlängern kann. Diese Eigenschaft ist entscheidend für die PCR, da sie es ermöglicht, die DNA bei hohen Temperaturen zu trennen und dann bei einer niedrigen Temperatur wieder zusammenzufügen.

💡Denaturierung

Denaturierung ist der Prozess, bei dem die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufgespalten wird, was für die PCR notwendig ist. Im Skript wird erwähnt, dass die Temperatur auf 90°C erhöht wird, um die DNA zu denaturieren und die Einzelstränge für die anschließende Verlängerung durch die DNA-Polymerase verfügbar zu machen.

💡Annealing

Annealing bezieht sich auf den Prozess, bei dem die Primer an die komplementären Sequenzen der DNA kleben, um die Position für die DNA-Polymerase zu markieren, an der die Verlängerung beginnen soll. Im Video wird dies als ein Schritt in der PCR-Reaktion beschrieben, bei dem die Temperatur auf die Annealing-Temperatur von 50-60°C gesenkt wird, um die Primer an die DNA zu binden.

💡Elongation

Elongation ist der dritte und letzte Schritt in der PCR-Reaktion, bei dem die DNA-Polymerase die neue DNA-Kette aufbaut. Nach dem Annealing wird die Temperatur auf etwa 70°C erhöht, was die optimale Arbeitstemperatur für die DNA-Polymerase ist, um die Nukleotide an die Primer zu koppeln und die DNA-Kette zu verlängern, wie im Skript beschrieben.

💡Primer

Primer sind kurze, spezifische Oligonukleotide, die als Startpunkt für die DNA-Polymerase dienen, um die neue DNA-Kette zu beginnen. Im Video werden Primer als zwei unterschiedliche Sequenzen beschrieben, die an den Enden der zu amplifizierenden DNA-Abschnitte positioniert sind und die DNA-Polymerase an der richtigen Stelle binden, um die Verlängerung zu initiieren.

💡Amplifikation

Amplifikation ist der Prozess der exponentiellen Vervielfältigung eines DNA-Abschnitts. Im Video wird erklärt, dass durch die Wiederholung der PCR-Reaktionen ein spezifischer DNA-Abschnitt exponentiell vervielfältigt wird, was bedeutet, dass die Menge der DNA im Laufe der Reaktionszyklen stark anwächst.

💡Gelelektrophorese

Gelelektrophorese ist eine Technik zur Analyse von DNA oder Proteinen, indem sie in einem Gel unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes migrieren. Im Video wird sie als Methode zur Sichtbarmachung der amplifizierten DNA erwähnt, um die Erfolgreiche Vervielfältigung zu überprüfen und die Größe des DNA-Fragments zu bestimmen.

💡Rekombinantes Humaninsulin

Rekombinantes Humaninsulin ist ein Beispiel für eine gentechnologisch hergestellte Substanz, die durch die Verwendung von PCR und weiteren Methoden in Mikroorganismen produziert wird. Im Video wird dies als Anwendung der PCR-Technik genannt, um therapeutisch wichtige Proteine herzustellen, die normalerweise schwer oder unmöglich zu isolieren sind.

Highlights

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Standardmethode in der Molekularbiologie zur Vervielfältigung von DNA-Abschnitten.

PCR basiert auf den Mechanismen der zellulären DNA-Replikation, jedoch in vitro durchgeführt.

Die doppelsträngige DNA (Template) wird durch Hitze getrennt, um Einzelstränge zu erzeugen.

DNA-Polymerase synthetisiert neue Tochterstränge von der Einzelstrang aus.

Die Reaktion wird exponentiell durch Wiederholungen vervielfältigt, was eine starke Amplifikation ermöglicht.

Kleine Mengen an Ausgangs-DNA sind für die Amplifikation ausreichend, da die Reaktion hoch spezifisch ist.

Der Reaktionsansatz enthält vier verschiedene Nukleotide als Bausteine für die DNA.

Eine hitzestabile DNA-Polymerase, wie die Taq-Polymerase, wird verwendet, die nach Erhitzung noch funktionstüchtig bleibt.

Zwei verschiedene Primer werden verwendet, um die DNA-Polymerase an die passenden Stellen zu binden.

Die Reaktionsabläufe bestehen aus Denaturierung, Annealing und Elongation.

Die Temperatur wird in jedem Zyklus gezielt erhöht und verringert, um DNA-Strang zu trennen und neue zu synthetisieren.

Nach dem ersten Reaktionszyklus verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Stränge.

Mit jedem Zyklus nimmt die Anzahl der DNA-Moleküle exponentiell zu.

Nach ca. 30 Zyklen kann das DNA-Fragment um den Faktor 10^6 bis 10^12 amplifiziert werden.

Die amplifizierte DNA kann mittels Gelelektrophorese visualisiert und analysiert werden.

PCR ermöglicht die Nachweisbarkeit von Erreger-DNA und die Identifizierung von Mikroorganismen, die schwer oder nicht kultivierbar sind.

Die Methode findet Anwendung in der Herstellung therapeutisch eingesetzter Proteine wie rekombinantes Humaninsulin.