Collagen Extraction || GATE Biotechnology BT || Biomaterials || Tissue Engineering

Summary

El video ofrece una explicación detallada de los procedimientos de aislamiento de colágeno, que incluyen preparación de la muestra, extracción, purificación y reorganización de la molécula de colágeno. Se discuten métodos como la precipitación con sales, extracción ácida y el método enzimático, destacando la importancia de la dialisis y la cromatografía de intercambio cationico para purificar el colágeno. Además, se menciona la reconstrucción de la estructura fibrosa del colágeno para restaurar su integridad después de los procesos de extracción.

Takeaways

• 🔬 Hay cuatro pasos principales en el procedimiento de aislamiento de colágeno: preparación de la muestra, extracción de colágeno, purificación y reformación de la molécula de colágeno.
• 🐂 Las tendones son una fuente preferida para el aislamiento de colágeno, ya que son ricas en este.
• ❄️ Se refrigeran las tendones en agua destilada a 4°C durante tres días para minimizar la contaminación no deseada.
• 💧 El agua en la que se sumergen las tendones se cambia dos veces al día para mantener la pureza del colágeno.
• 🔪 Después de la preparación, las fibras de colágeno se cortan en trozos pequeños y se pulverizan para facilitar la extracción.
• 🧂 El método de precipitación con sales es una técnica común para extraer colágeno, donde se utiliza una solución salina para inducir la autoensamblaje de las moléculas de colágeno.
• 🧬 La diálisis es un paso importante en la purificación del colágeno, permitiendo la eliminación de otros componentes no deseados.
• 🌡️ El método de extracción ácida involucra sumergir las tendones en una solución ácida para solubilizar el colágeno, con EDTA como agente antibacteriano.
• 🧪 El método enzimático de aislamiento de colágeno utiliza pepsina para digestión selectiva, ayudando a purificar el colágeno de otras proteínas.
• 🧬 La cromatografía de intercambio cationico es una técnica de purificación adicional que utiliza la carga eléctrica para separar el colágeno de otras proteínas.
• 🔄 La reconstrucción del colágeno es un paso final que ayuda a restaurar la estructura original del colágeno después de los procesos de extracción y purificación.

Q & A

¿Cuáles son los cuatro pasos principales en el procedimiento de aislamiento de colágeno?

Los cuatro pasos principales en el aislamiento de colágeno son: preparación de la muestra, extracción de colágeno de la muestra, purificación de colágeno de otras proteínas no colágenas y reorganización de la molécula de colágeno.

¿Por qué se prefieren los tendones como fuente para la extracción de colágeno?

Los tendones son preferidos como fuente de colágeno porque son ricas en este y son más accesibles para su extracción.

¿Cómo se realiza la preparación de la muestra de colágeno?

La preparación de la muestra de colágeno implica suspender los tendones en agua destilada fría a 4 grados Celsius durante tres días, cambiar el agua dos veces al día, descongelar y lavar los tendones con agua fría, cortar los fibras colágenas en trozos pequeños y pulverizarlos, y luego secarlos durante 24 horas a 40-45 grados Celsius.

¿Qué son los tres métodos importantes para la extracción de colágeno?

Los tres métodos importantes para la extracción de colágeno son el método de precipitación con sales, el método de extracción ácida y el método enzimático.

¿Cómo funciona el método de precipitación con sales para extraer colágeno?

El método de precipitación con sales implica aumentar la concentración de sales en la solución para que los colágenos, que son lipófilos, se autoensamblen y se precipiten, rodeados por una capa de agua y sales.

¿Qué es la diálisis y cómo se utiliza en la purificación del colágeno?

La diálisis es un proceso que utiliza una membrana permeable para separar sustancias disueltas en un líquido. En la purificación del colágeno, se utiliza para eliminar proteínas no deseadas y otros contaminantes, dejando aisladas las proteínas colágenas.

¿Cuál es el propósito de utilizar ADTA en el método de extracción ácida de colágeno?

El ADTA se utiliza en el método de extracción ácida como agente antibacteriano para evitar el crecimiento de biofilms y como agente de complexación para evitar la presencia de cations divalentes.

¿Qué es el método enzimático de extracción de colágeno y cómo funciona?

El método enzimático de extracción de colágeno implica tratar los tendones con acetato de sodio y luego agregar pepsina para realizar la digestión enzimática. Esto ayuda a solubilizar las fibras colágenas y a remover las proteínas no deseadas.

¿Qué es la cromatografía de intercambio cationico y cómo se utiliza en la purificación del colágeno?

La cromatografía de intercambio cationico es un método que utiliza colunas con partículas cargadas negativamente para atraer aminoácidos con carga positiva, permitiendo separar proteínas colágenas positivamente cargadas de otras proteínas no deseadas.

¿Por qué es necesario realizar la reconstrucción de la molécula de colágeno después de la extracción?

La reconstrucción de la molécula de colágeno es necesaria porque las fibras colágenas pueden estar dañadas o desorganizadas después de los procesos de extracción. Este paso ayuda a restaurar la estructura original del colágeno.

Outlines

00:00

🔬 Procedimientos de Isolación de Colágeno

El primer párrafo introduce el tema de la discusión sobre los procedimientos de aislamiento de colágeno, destacando los cuatro pasos principales: preparación de la muestra, extracción de colágeno, purificación y reformación de la molécula de colágeno. Se menciona que las tendones son una fuente preferida para el aislamiento y se describe el proceso de preparación de la muestra, incluyendo la hidratación en agua fría y la limpieza para eliminar impurezas. El colágeno se corta en trozos pequeños y se pulveriza antes de ser secado. Se presentan tres métodos de extracción: precipitación con sales, extracción ácida y método enzimático, y se discute brevemente la teoría detrás de la precipitación con sales.

05:02

🧪 Métodos de Extracción de Colágeno

El segundo párrafo se enfoca en los métodos de extracción de colágeno, incluyendo la precipitación con sales, donde el aumento de concentración de sales provoca la autoensamblaje de las moléculas de colágeno. Se describe el proceso detallado de diálisis para purificar el colágeno, eliminando reagentes no deseados. El método de extracción ácida se discute con la utilización de ácido y EDTA para prevenir la formación de biofilms y la generación de cations. El método enzimático se presenta como una alternativa, utilizando ácido acético y pepsina para solubilizar y purificar el colágeno. Al final, se menciona la necesidad de una solución de colágeno puro para propósitos experimentales y se describe el proceso de diálisis para alcanzar esta pureza.

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🛠 Purificación y Reconstrucción de Colágeno

El tercer párrafo se centra en la purificación y la reconstrucción de colágeno. Se explica cómo la extracción puede alterar la estructura de las fibras de colágeno, y por lo tanto, es necesario volver a construir su estructura original utilizando metales como calcio o zinc. Se discute el uso de cromatografía de intercambio cationico para purificar el colágeno, aprovechando la carga positiva de las proteínas colagenicas en comparación con otras proteínas no colagenicas. Se describe el uso de carbóximetilcelulosa como un grupo de intercambio negativamente cargado en la cromatografía. Además, se menciona la posibilidad de reconstruir las enlaces cruzados rotos utilizando aldehídos neutros.

Keywords

💡Colágeno

El colágeno es una proteína fibrosa presente en los tejidos conectivos del cuerpo humano y en algunos animales. Es fundamental en la estructura y la cohesión de la piel, huesos, tendones y ligamentos. En el video, se discute el proceso de aislamiento del colágeno, destacando su importancia en la investigación y aplicaciones biomédicas.

💡Isolemento

El isolemento del colágeno es el proceso de separarlo de otros componentes de los tejidos biológicos. Es un tema central del video, donde se describen los pasos necesarios para obtener colágeno puro, lo que es crucial para estudios y aplicaciones en la industria de la salud y la cosmética.

💡Extracción

La extracción de colágeno se refiere a uno de los pasos del proceso de isolemento, que puede realizarse mediante varios métodos como la precipitación con sales, el método ácido o el método enzimático. En el script, se explica cómo cada método contribuye a la obtención de colágeno puro.

💡Purificación

La purificación es el proceso de separar el colágeno de otras proteínas no deseadas y de los reagentes utilizados en la extracción. Es esencial para obtener una muestra de colágeno libre de contaminantes, como se menciona en el video al describir técnicas como la diálisis y la cromatografía de intercambio cationico.

💡Precipitación con sales

Es un método de extracción del colágeno que implica el uso de sales para inducir la autoasociación de las moléculas de colágeno. En el script, se describe cómo la concentración de sales afecta la solubilidad del colágeno y cómo se usa para precipitar y separarlo de la mezcla.

💡Diálisis

La diálisis es una técnica utilizada para purificar el colágeno eliminando los reagentes y otras proteínas no deseadas. En el video, se menciona cómo la diálisis permite mantener el colágeno en un medio mientras que las otras proteínas se filtran hacia el exterior.

💡Método ácido

Este método de extracción del colágeno implica la utilización de un ácido para tratar los tendones y solubilizar el colágeno. En el script, se discute cómo el uso de pH ácido y la presencia de EDTA ayuda a prevenir la formación de biopelículas y a solubilizar el colágeno.

💡Método enzimático

El método enzimático es una técnica de isolemento del colágeno que utiliza enzimas, como la pepsina, para digester y solubilizar las proteínas. En el video, se destaca cómo este método permite obtener colágeno puro y libre de otras proteínas no deseadas.

💡Cromatografía de intercambio cationico

Es una técnica de purificación que se utiliza en el proceso final de isolemento del colágeno. En el script, se describe cómo la cromatografía puede separar el colágeno de otras proteínas en base a sus cargas eléctricas, utilizando carbóximetilcelulosa como material para las esferas de la columna.

💡Reconstrucción

La reconstrucción del colágeno es el proceso de volver a formar su estructura original después de la extracción y la purificación. Es importante para restaurar la fibrilación y la integridad del colágeno, como se menciona en el video al describir el uso de metales y aldehídos para esta finalidad.

Highlights

Introduction to the four main steps in collagen isolation procedures.

Explanation of sample preparation, including the selection of collagen sources and initial cleaning process.

Description of the cold distilled water treatment for tendons to remove non-collagenous tissue.

Process of cutting collagen fibers into small pieces and their subsequent drying for further extraction.

Overview of three extraction methods: salt precipitation, acid extraction, and enzymatic isolation.

The theory behind salt precipitation and its role in collagen self-assembly.

Use of dialysis in collagen purification to remove non-collagenous proteins.

Details on the salt precipitation method, including the use of neutral salt solutions and centrifugation.

The role of pH in collagen solubility and its impact on the extraction process.

Process of acid isolation, including the use of acidic solutions and the antibacterial properties of EDTA.

Enzymatic method of collagen isolation, emphasizing the use of pepsin for proteolysis.

The significance of multiple rounds of purification to ensure the purity of collagen.

Technique of salting out to precipitate pure collagen from the supernatant.

The necessity of dissolving precipitated collagen for experimental purposes.

Use of dialysis to remove reagents such as acetic acid and pepsin from the collagen solution.

Extra purification step involving cation exchange chromatography for further refinement of collagen.

The reconstruction of collagen to restore its original fibrous structure after extraction.

Application of metal ions and cross-linking agents in collagen reconstruction.

Principle of cation exchange chromatography and its use in separating collagen from other proteins.

Transcripts

hello guys welcome to my youtube channel

so today we are going to discuss

collagen isolation procedures so there

are mainly four steps in collagen

isolation procedures the first step is

the preparation of the sample second

step is the extraction of collagen from

the sample third step is the

purification of collagen from the other

non collagenous proteins and fourth step

is the reformation of the collagen

molecule so these are basically four

steps in the total isolation procedure

of collagen so first is the preparation

of collagen so first we have to choose a

source from which collagen can be

isolated so generally tendons are the

preferred sources of choice from which

collagen can be isolated so

are tendency in cold distilled water at

four degree celsius for three days so

first they are suspended it playing

water for four degrees celsius at three

days next the water was changed two

times per day because what happens

sometimes we tend on some

non uh tendon thing or the uh something

which we are not interested they also

come out from the tissues so the water

needs to be changed and we are

purely interested in only collagen

nothing other than that so after that

uh so after this water changing so fixed

mass of tendon was defrosted and washed

with cold water several times so why

because

when you defrost or decelerate tendon

what happens the collagen pieces tend to

come out from the tendon so this purpose

of this step is to get collagen from the

tendons next the collagen fibers were

cut into small pieces of one centimeter

in length and pulverized in a mill this

is purely for our

experimental purposes and then they are

dried for 24 hours at 40 to 45 degree

celsius so now we have prepared our

collagen

sample from which we will do further

extraction procedures

so extraction can be performed by three

important procedures either by salt

precipitation method either by acid

extra extraction method or by enzymatic

isolation method so we can use any one

of the procedures to extract pure

collagen all right so first let us

discuss the theory behind salt

extraction so as you can see in any sort

of salt precipitation what happens uh

suppose these are the

blue ones are the collagen molecule here

you have the water molecule and here you

have the salt so when the salt

concentration is much lower collagen and

water will more or less mix with each

other but as you increase the

concentration of salt what happens

collagen molecules they are hydrophobic

in nature so they will

only a self assemble with each other and

they will be surrounded by the

interaction of water and the salt

molecules all right so in this way

gradually collagen molecules will self

assemble with each other and they will

be sounded by a layer of water and salt

so in this way you can get you can

precipitate collagen from the entire

mixture so this is the method basic

method of salting out likewise you have

dialysis of collagen where you can keep

the collagen along with the

media in a dialysis bank so what happens

all the non collagenous proteins and

other proteins which we are not

interested

they will go out into the medium and the

collagen will be pure collagen will

remain in the

back dialysis back after that we can

isolate pure collagen from the dialysis

bank

so generally there are two different

methods there is another third matter so

these two are basically chemical

chemical methods of collagen extraction

so number one is a salt precipitation

method so in salt precipitation method

what happens you create treat tendon

pieces with neutral soil solutions like

0.05 molar na2hpo4

at ph of 8.8 to 9.6 now what is the

reason of treating collagen with this

neutral soil solution the reason is that

purified collagen swells little and

dissolves hardly at ph ranges from 5 to

11 so if you add a little bit of neutral

solution they can dissolve readily in

this ph range so the basics idea of

using neutral source solution is that to

have a good solubility of collagen into

the

isolation medium then they have

centrifuge and for 40 000 to 50 000 g

for one to two hours to remove suspended

particles all the non collagenous

proteins or the extra

uh particles that we are not interested

in they are removed by centrifugation

and the collagen was

isolated from the supernatant then they

are treated with the sodium chloride

solution this here they are performing

salting out method so what will happen

the chloride ions will gradually

surround the collagen molecule and the

collagen molecule will self assemble

and they are using here four molar nacl

at five degrees celsius so whatever they

have got the collagen from the salting

out they are again performing dialysis

all right uh so

why dialysis because you have used uh

some reagents like neutral salt solder

neutral salts in it to hpo4 or nacl so

after you get the pure collagen you need

to remove this extra reagents which you

have used in the isolation procedure so

dialysis is basically

for purification

and to remove the nh2 hpo4 and nacl that

you have used before

and any other reagent then you have the

method of acid isolation so acid

isolation what you do you

soak tendon pieces with 0.5 molar acidic

acid in presence of 5 millimolar adta

now what is the purpose ability is that

purpose abilities it acts as an

antibacterial agent why because it does

not allow

to grow biofilms so when you are

isolating collagen because it is

actually a tissue extract sometimes

whatever bacterial growth might occur

biofilm growth can occur so if you add

an eta that

it will not

let bacteria or biofilms to grow on it

moreover it is also generating agent so

it can also cheat

if present some divalent uh cations also

so the ph is 2.523 which is acidic ph

and for 48 to 96 hours at four day

celsius on four day celsius so under

constant temperature and pressure then

the supernatant

and then you are centrifuging it again

and the supernatant that you are getting

is the acid soluble fraction of the

collagen you are filtering that and the

filtrate was again salted out with nacl

like the previous case you are also

applying salting out method in this case

also

[Music]

next we come to the biological method of

collagen isolation which is the

enzymatic method of collagen isolation

so here what you are doing you are first

performed treating the tissue with 0.05

molar na2hpo4 solution at ph 8.7 to

9.104 degrees celsius to remove all the

non collagenous proteins and then you

are isolating pure tendons only tendons

you are not isolating any other thing

other than the tendon other extra things

have been removed next you are uh

your

next you are

treating this tendon pieces with 0.5

molar acetic acid in presence of 5

millimolar adta so or in presence of

acetic acid vdt what happens from the

tendon the collagen fibers come out so

and then you dissolve that collagen

fibers

in

uh the media and then you add pepsin for

24 hours have four digesters now white

pepsi sometimes uh tendons not only

contain collagen but other

non-collagenous proteins to remove

the other non-collagenous proteins you

have prevention which will actually

perform proteolysis so then this process

is repeated three to four times then

after that it is centrifuge at 5000 g

for 15 minutes and the supernatant is

collected why because in the supernatant

the collagen will be there and in the

pellet other particles will be there

which we will we are not interested in

that

so from the supernatant by salting out

method we are isolating precipitate of

pure collagen so by salting out method

what we are getting precipitate of pure

collagen but we need solution of pure

collagen for experimental purposes so

what we will do we will dissolve it

again in one millimolar acidic acid and

then we are performing dialysis why

because we have used reagents like

acetic acid we have used reagents like

pepsin earlier and

and we don't need this reagents in our

final mixture so we will perform

dialysis with point zero two molar no2

hpo4 solution for 24 hours at 40

resources and finally on dissolving the

precipitate of pure correlation with

acetic acid we get the solution of pure

collagen which was

our

target

[Music]

so

uh after getting solution of pure

collagen we again perform sometimes

purification step this is extra

purification step which we are

performing with the help of cation

exchange chromatography

and after all this purification and

extraction

sometimes reconstruction of collagen is

also done why reconstruction of collagen

is done because the collagen that you

get after acid extraction of salt

extraction that collagen if you see on

the electron microscope you will see

that most of the fibrous are

badly disrupted so after acid extraction

or salt extraction what happens most of

the collagen fibers get

disturbed and they are badly disrupted

so you need to reconstruct that collagen

into the original structure so this step

is purely for that by adding certain

metal lines like l3 plus zn2 plus ca2

plus you can also perform this

reconstruction and if some cross linking

gets broken then you can perform this by

neutral aldehyde

[Music]

now purification how you can do as you

can see in case of cation exchange

chromatography if i talk about the

principle you can use the negatively

charged beads all right so these are the

negatively charged bits and you uh pour

in the mixture of amino acids positively

charged amino acid and negatively

charged amino acids so you pour in the

mixture of positively and negatively

charged amino acids now what will happen

the negatively charged beads will have

attraction for the positively charged

amino acids so the positively charged

amino acid will bind to this negatively

charged

bit column okay so the column contains

negatively charged b so the positively

charged amino acids will get bound to

this

negatively charged bits and the

negatively charged amino acids because

of electrostatic repulsion they will

flow out all right they will not bind

and they will float in this way you can

separate the positively charged

particles from the negatively charged

particles by cation exchange

chromatography

all right so in case of cross collagen

extraction or collagen purification we

use carboxy methyl cellulose

group in the ionized form which in the

ionized form is negatively charged so we

can use it in construction of beads in

the column so and collagen is positively

charged hp is less than seven so if we

design a cation exchange chromatography

where we use

ionized form of carboxymethyl cellulose

as beads and if we then pour the mixture

of collagen and other proteins what will

happen collagen because it is positively

charged will get attracted and stick to

the negatively charged carboxymethyl

group and the other non-collagenous

proteins will flow so in this way we can

purify the collagen

[Music]