005 Teorico Purificacion de Proteinas

Química Biológica

9 Apr 202022:49

Summary

TLDREn esta clase se exploran diversos métodos de cuantificación, purificación y separación de proteínas en mezclas complejas. Se destacan tres pasos clave: identificar la proteína de interés, medir su cantidad y purificarla. Los métodos incluyen la precipitación salina, la diálisis, la cromatografía y la centrifugación diferencial. Además, se abordan técnicas específicas como el tratamiento térmico y la cromatografía de afinidad, que permiten purificar proteínas según sus características fisicoquímicas. A través de estos procedimientos, se obtiene una proteína pura que puede ser analizada o utilizada en investigaciones posteriores.

Takeaways

😀 La cuantificación de proteínas se basa en tres pasos: identificar la proteína de interés, medir su cantidad y purificarla a través de diferentes métodos.
😀 La purificación de proteínas puede ser general (como precipitación y tratamiento térmico) o específica (como métodos cromatográficos, dependiendo de las características de la proteína).
😀 Los métodos generales de purificación incluyen la precipitación salina, que se basa en interacciones iónicas, y la diálisis, que utiliza una membrana semipermeable para separar moléculas por tamaño.
😀 El tratamiento térmico desnaturaliza las proteínas a altas temperaturas, permitiendo que algunas proteínas sobrevivan mejor a estos tratamientos en comparación con otras, lo cual es útil en purificación.
😀 Los métodos cromatográficos permiten separar proteínas por sus propiedades específicas como tamaño, carga o afinidad. Estos métodos incluyen la cromatografía de exclusión molecular, intercambio iónico y afinidad.
😀 La cromatografía de exclusión molecular separa las proteínas por su tamaño, donde las más grandes pasan más rápido que las más pequeñas, que se retienen dentro de los poros de la resina.
😀 En la cromatografía de intercambio iónico, las proteínas se separan según su carga, utilizando una resina cargada para atraer proteínas con carga opuesta, y luego eluirlas usando un gradiente de pH o salino.
😀 La cromatografía de afinidad se basa en interacciones específicas y reversibles entre la proteína de interés y un ligando inmovilizado en la resina, permitiendo su purificación de manera eficiente.
😀 Los 'tags' de afinidad, como el tag de distina o glutatión S-transferasa, se utilizan para purificar proteínas recombinantes al unirlas a la resina específica para ese tag.
😀 La cromatografía hidrofóbica utiliza resinas con grupos hidrofóbicos para separar proteínas según su grado de hidrofobicidad, eludiendo las proteínas con solventes de diferente fuerza iónica.
😀 La cromatografía líquida de alta performance (HPLC) se usa para obtener una alta resolución en la separación de proteínas, utilizando resinas de partículas finas para mejorar la interacción con las proteínas.

Q & A

¿Cuáles son los tres puntos clave a tener en cuenta al cuantificar y purificar proteínas?
-Los tres puntos clave son: 1) Identificar la proteína de interés de manera específica, 2) Medir la cantidad de la proteína, y 3) Realizar el proceso de purificación de la proteína, que puede incluir varios pasos.
¿Qué métodos se utilizan para identificar la proteína de interés?
-Se pueden utilizar ensayos específicos, como la medición de la actividad biológica de la proteína (por ejemplo, en el caso de una enzima, medir la producción de su producto) o métodos espectrofotométricos y espectrofluorométricos para detectar interacciones de la proteína con un ligando.
¿Cuál es el primer paso en el proceso de purificación de proteínas?
-El primer paso es procesar el material biológico, que incluye la homogeneización para obtener un extracto crudo.
¿Qué técnicas se utilizan para procesar el material y obtener un extracto crudo?
-Se pueden usar diversas técnicas, como licuadoras, homogeneizadores, ultrasonido, y prensas, o incluso nitrógeno líquido para congelar el tejido y facilitar su ruptura.
¿En qué consiste la centrifugación diferencial?
-La centrifugación diferencial separa los componentes celulares en función de su tamaño y densidad mediante centrifugación a diferentes velocidades, permitiendo la obtención de distintos componentes, como células enteras, núcleos y otros compartimentos subcelulares.
¿Qué diferencia existe entre métodos de purificación de baja y alta resolución?
-Los métodos de baja resolución, como la precipitación salina, tienen bajo rendimiento y baja purificación, mientras que los de alta resolución, como los métodos cromatográficos, son más específicos y logran una mayor purificación y rendimiento de la proteína.
¿Cómo funciona la precipitación salina en la purificación de proteínas?
-La precipitación salina se basa en el aumento de la fuerza iónica, que reduce la solubilidad de las proteínas debido a interacciones hidrofóbicas, y se utiliza principalmente para eliminar proteínas no deseadas.
¿Qué es la diálisis y cómo se aplica en la purificación de proteínas?
-La diálisis es una forma de filtración molecular que separa las moléculas por su tamaño utilizando una membrana semipermeable. Es útil para eliminar pequeños solutos, como sales, tras pasos de purificación, como la precipitación salina.
¿Cómo afecta el tratamiento térmico a la purificación de proteínas?
-El tratamiento térmico se basa en la desnaturalización de proteínas a temperaturas elevadas, lo que permite purificar la proteína de interés si se realiza en presencia de un ligando específico que proteja a la proteína de interés de la desnaturalización.
¿Cuáles son los tipos de cromatografía utilizados para la purificación de proteínas?
-Los métodos cromatográficos incluyen la cromatografía de exclusión molecular (filtración en gel), la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, la cromatografía hidrofóbica, y la cromatografía líquida de alta performance (HPLC), cada una con su propio principio de separación, ya sea por tamaño, carga, afinidad o hidrofobicidad.