PCR: Reacción en cadena de la polimerasa [TEÓRICO Y PRÁCTICO]
Summary
TLDREste vídeo educativo explica la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), desarrollada por Kary Mullis en 1986, que le valió el Nobel en 1993. Se describe el proceso teórico y práctico de la PCR, que permite la amplificación masiva de moléculas de ADN a partir de muestras minúsculas. Se detallan los pasos clave como la desnaturalización, hibridación y polimerización, así como factores que influyen en la eficiencia y especificidad de la técnica. Además, se mencionan aplicaciones de la PCR en diagnóstico médico, identificación forense y clonación de genes.
Takeaways
- 🧬 El bioquímico estadounidense Kary Mullis desarrolló el método de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) en 1986, lo que le valió el Premio Nobel en 1993.
- 🔬 La PCR permite multiplicar enormemente el número de moléculas de ADN de una muestra de tamaño ínfimo en pocas horas y sin necesidad de células vivas.
- 🧩 Se requieren dos fragmentos de ADN complementarios, llamados cebadores o primers, para iniciar la amplificación de la secuencia específica de interés.
- 🌡️ El proceso de PCR se basa en tres etapas repetitivas: desnaturalización, hibridación y polimerización, que ocurren a temperaturas específicas.
- ⏱️ La temperatura de desnaturalización generalmente es de 94 grados, la de hibridación entre 55 y 60 grados, y la de polimerización entre 68 y 72 grados.
- 🔎 La elección y diseño de los primers son críticas para la eficiencia y especificidad de la PCR; se recomienda verificar su especificidad mediante búsquedas en bases de datos.
- 🧪 Se utiliza una solución que contiene ADN polimerasa, los cuatro nucleótidos, los primers y la muestra de ADN para realizar la reacción.
- 🔬 La TAQ polimerasa, aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus, es esencial en la PCR debido a su estabilidad a altas temperaturas.
- 🧬 La PCR es sensible y puede detectar secuencias mínimamente representadas en una muestra, lo que la hace útil en diagnósticos y análisis genéticos.
- 🔎 La técnica de PCR se utiliza en diagnóstico de ADN, identificación de huellas genéticas, clonado de genes, pruebas de paternidad y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Q & A
¿Quién desarrolló el método de PCR y en qué año?
-El bioquímico estadounidense Kary Mullis desarrolló el método de PCR en 1986.
¿Por qué se le otorgó el premio Nobel a Kary Mullis?
-Kary Mullis recibió el premio Nobel en 1993 por su desarrollo de la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).
¿Qué es la PCR y cómo funciona?
-La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es un método de laboratorio que permite multiplicar enormemente el número de moléculas de ADN de una muestra de tamaño ínfimo. Funciona a través de ciclos de desnaturalización, hibridación y polimerización para duplicar la cantidad de ADN deseado.
¿Qué son los 'primers' en la técnica de PCR y qué función cumplen?
-Los 'primers' son fragmentos cortos de ADN complementarios al comienzo y al final de la secuencia específica que se quiere amplificar. Sirven como puntos de inicio para la síntesis de las nuevas cadenas de ADN durante la reacción de PCR.
¿Cuál es la importancia de la elección adecuada de los 'primers' en la PCR?
-La elección adecuada de los 'primers' es crucial para la especificidad de la PCR, ya que deben ser complementarios a la secuencia de interés y evitar la amplificación de secuencias no deseadas.
¿Qué pasos componen un ciclo de PCR?
-Un ciclo de PCR consta de tres pasos: desnaturalización (separación de las cadenas de ADN), hibridación (apareamiento de los 'primers' con el ADN) y polimerización (síntesis de las nuevas cadenas de ADN).
¿Cuál es la temperatura típica utilizada para la desnaturalización en la PCR y por qué?
-La temperatura típica para la desnaturalización es de 94 grados Celsius, ya que es la máxima temperatura que las enzimas comunes pueden soportar sin una pérdida sensible de actividad.
¿Qué es la enzima Taq Polimerasa y de qué se utiliza en la PCR?
-La Taq Polimerasa es una enzima termorresistente que se aísló de la bacteria termófila Thermus aquaticus. Se utiliza en la PCR para catalizar la síntesis de las nuevas cadenas de ADN sin ser inactivada por los ciclos de calentamiento.
¿Cuáles son algunas de las aplicaciones de la técnica de PCR en la biología y la medicina?
-Las aplicaciones de la PCR incluyen el diagnóstico de ADN, la identificación de huellas genéticas, el clonado de genes, las pruebas de paternidad, el diagnóstico de enfermedades infecciosas como el COVID-19 y la detección de enfermedades hereditarias.
¿Qué es una 'master mix' en la técnica de PCR y por qué es útil?
-Una 'master mix' es una mezcla de reacción de mayor volumen que contiene todos los reactivos necesarios para la PCR, excepto uno que se agregará individualmente a cada tubo. Es útil para evitar errores de pipetteo y para asegurar que todas las muestras tengan la misma cantidad de reactivos.
Outlines
🔬 Introducción a la PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa
Este primer párrafo introduce la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) desarrollada por Kary Mullis en 1986, que le valió el Premio Nobel en 1993. La PCR permite multiplicar enormemente el número de moléculas de ADN a partir de muestras de tamaño extremadamente pequeño. Se explica que la técnica se basa en el proceso natural de replicación del ADN, pero se realiza en condiciones in vitro y en un tiempo mucho más corto. Se menciona que la técnica requiere la síntesis de dos fragmentos de ADN complementarios, conocidos como 'cebadores' o 'primers', que se utilizan para delimitar la secuencia específica que se desea amplificar. Además, se describe el proceso de elección de la secuencia a amplificar y la importancia de los 'primers' en la técnica.
🧬 Detalles de la técnica PCR y factores críticos
En el segundo párrafo se profundiza en los detalles de la técnica PCR, explicando los tres pasos clave del proceso: desnaturalización, hibridación y polimerización. Se menciona la importancia de la temperatura en cada etapa y cómo estas afectan la eficiencia y especificidad de la reacción. Se destaca la crítica selección de los 'primers', ya que incluso un pequeño error en su diseño puede resultar en amplificaciones no deseadas. Además, se discute el papel de la enzima DNA polimerasa, especialmente la termoestable Taq, y la necesidad de cationes como el magnesio para su actividad. Se aborda la sensibilidad de la PCR y su aplicación en diversos campos, como el diagnóstico de enfermedades, identificación de huellas genéticas y la detección de enfermedades infecciosas.
🧪 Procedimiento de la PCR en el laboratorio
El tercer párrafo describe el procedimiento de la PCR en la práctica, desde la preparación de los materiales y la configuración del área de trabajo hasta la ejecución de la reacción en un termociclador. Se enfatiza la importancia de evitar la contaminación y se detallan los componentes necesarios para la reacción, como el buffer, los NTPs, los 'primers', la enzima Taq polimerasa y la muestra de ADN. Se explica el concepto de 'master mix' y cómo se prepara y distribuye en tubos para la reacción. Finalmente, se menciona el uso de un termociclador programado con un protocolo específico de amplificación, que incluye temperaturas y tiempos para cada etapa de la PCR. Se concluye con la mención de la siguiente técnica a utilizar, la electroforesis en gel de agarosa, para visualizar los resultados de la PCR.
Mindmap
Keywords
💡Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
💡Desnaturalización
💡Hibridación
💡Polimerasa
💡Cebadores o Primers
💡Nucleótidos
💡Magnesio
💡Térmociclador
💡Electroforesis
💡Amplificación Exponencial
Highlights
Kary Mullis, un bioquímico estadounidense, desarrolló el método de PCR en 1986.
La PCR permite multiplicar enormemente el número de moléculas de ADN de una muestra de tamaño ínfimo.
Kary Mullis recibió el Premio Nobel en 1993 por su desarrollo de la PCR.
La PCR se basa en el proceso natural de replicación del ADN.
Se pueden obtener millones de copias de ADN in vitro en unas pocas horas con PCR.
Para la PCR se requieren cebadores o primers, que son fragmentos de ADN complementarios al inicio y al final de la secuencia específica que se quiere amplificar.
Los primers son sintetizados y tienen secuencias diferentes para diferenciarlos: primer forward y primer reverse.
La PCR se realiza a través de tres etapas repetitivas: desnaturalización, hibridación y polimerización.
La temperatura de desnaturalización generalmente es de 94 grados para separar las cadenas de ADN.
La hibridación permite que los primers se unan al ADN mediante complementariedad de bases.
La polimerización es催化da por la ADN polimerasa y se realiza a 68 a 72 grados.
La eficiencia y especificidad de la PCR dependen del diseño de los primers y la selección de la enzima utilizada.
La Taq polimerasa, aislada de bacterias termófilas, es comúnmente usada en la PCR y es resistente a los ciclos de calentamiento.
Los factores que afectan la PCR incluyen la concentración de magnesio, que es esencial para la actividad de la enzima.
La PCR es sensible y puede detectar secuencias mínimamente representadas en una muestra.
La técnica de PCR tiene aplicaciones en el diagnóstico del ADN, identificación de huellas genéticas, clonado de genes, pruebas de paternidad y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
La preparación de la reacción de PCR incluye la mezcla de buffer, NTPs, primers, Taq polimerasa y la muestra de ADN.
Se realiza una 'master mix' para evitar errores de pipetación y para facilitar la realización de múltiples reacciones.
El termociclador es utilizado para realizar los ciclos de temperatura necesarios para la PCR.
Después de la PCR, se utiliza la electroforesis en gel de agarosa para visualizar el fragmento de ADN amplificado.
Transcripts
en 1986 el bioquímico estadounidense
kary mullis desarrolló un método de
laboratorio que permite multiplicar
enormemente el número de moléculas de
adn de una muestra desconocida de tamaño
ínfimo la técnica llamada reacción en
cadena de la polimerasa o pcr por sus
siglas en inglés le valió el premio
nobel en 1993 siete años después de
publicar sus resultados experimentales
en el vídeo de hoy vamos a ver la pcr
reacción en cadena de la polimerasa
vamos a ver primero una parte teórica y
al final del vídeo una parte práctica
bienvenidos a una nueva edición de
nutrimentos
la pcr se vale de un proceso que ocurre
en forma permanente en los sistemas
vivos y que hemos analizado en detalle
en la serie del adn y su replicación la
duplicación del adn por medio de ciclos
de desnaturalización copiado y re
aparentó de la doble cadena de adn que
se quiere amplificar en unas pocas horas
y sin necesidad de usar células vivas se
pueden obtener millones de copias in
vitro
para poner en práctica esta técnica se
requiere sintetizar dos fragmentos
cortos de adn complementarios al
comienzo y al final de la secuencia
específica que se quiere amplificar
llamados cebadores o prime art para
entender esto mejor vamos a
representarlo gráficamente cada una de
estas líneas representa una de las
hebras de adn complementarias de nuestra
muestra puede ser una muestra de adn de
una persona de una planta de un animal
de una bacteria o de un virus por
ejemplo lo primero que hacemos es elegir
un fragmento de todo este genoma que
queramos amplificar puede ser un
fragmento corto como por ejemplo de 50
pares de bases o menos o más largo como
de dos mil pares de bases el fragmento
que elijamos amplificar va a depender
del objetivo que tengamos para hacer la
pcr una vez que tenemos elegida la
secuencia a amplificar debemos
sintetizar los prime er que son pequeños
fragmentos de adn simple cadena de
alrededor de 20 pares de bases
complementarios a la zona
el comienzo y el final de la zona de
interés y de esta manera la delimitan
los dos primeros tendrán secuencias
diferentes ya que serán complementarios
a distintas zonas del adn para
diferenciarlos se los denomina prime air
forward y 1er
rivers hay que considerar que el
producto final de la pcr incluye a las
zonas complementarias a los prime ans
una vez que tenemos los primers la
muestra de adn se coloca en una solución
que contiene adn polimerasa los cuatro
nucleótidos en cantidad y los primers
mencionados
el método se basa en la repetición
cíclica de tres reacciones sucesivas
primero ocurre la desnaturalización la
solución se calienta para que las dos
cadenas de adn se separen
la temperatura de la cual la doble
hélice se desnaturaliza depende tanto
del largo del fragmento como del
contenido de hesse mientras mayor sea el
contenido de jefe mayor debe ser la
temperatura de desnaturalización y
mientras mayor sea el largo del adn
molde mayor debe ser el tiempo de
desnaturalización en general la
temperatura utilizada es 94 grados ya
que a lo largo de 30 ciclos es la máxima
temperatura que las enzimas comúnmente
usadas pueden soportar sin una pérdida
sensible de actividad para una pcr
estándar se recomiendan 30 a 45 segundos
a 94 grados
luego viene la etapa de hibridación o
deán y link en la que la temperatura se
reduce para permitir que los primers se
aparecen por complementariedad de bases
con el adn mol de la temperatura de
hibridación o any link es crítica dado
que una alta temperatura de any link
impedirá que el primer aparece con el
adn molde mientras que una baja
temperatura favorecerá el apareamiento
consecuencias que no son 100%
complementarias dando como resultado
amplificaciones inespecíficas este
parámetro debe ser determinado
experimentalmente y depende del
contenido de hesse y ate de los primers
y de su longitud en general suele rondar
los 55 a 60 grados centígrados
por último en la etapa de polimerización
la adn polimerasa cataliza la síntesis
simultánea de las dos cadenas a partir
de cada fragmento que actúa como primer
la polimerización o extensión se realiza
de 68 a 72 grados dependiendo de la
enzima utilizada y se calcula un minuto
por cada 1000 pares de bases a
amplificar
al cabo del primer ciclo de tres
reacciones el fragmento de adn elegido
se ha duplicado y por lo tanto se ha
duplicado la cantidad de adn molde
disponible para el segundo ciclo lo
mismo ocurre después de cada ciclo de
replicación y así se produce una
amplificación exponencial de moléculas
ahora veamos los factores que afectan la
eficiencia y especificidad de la pcr de
los tantos factores que pueden afectar
la eficiencia y la especificidad de una
pcr el más crítico es el diseño de los
primers dado que un olivo nucleótido de
15 bases estaría representado por azar
una única vez en un genoma como el
humano y en pos de la especificidad de
la pcr los primers son típicamente
sintetizados como oligonucleótidos de 15
a 24 bases de cualquier manera es
altamente recomendable cerciorarse
mediante una búsqueda en la base de
datos apropiada de que los primers de
interés no amplifican ninguna otra
secuencia que la deseada si bien existen
numerosas recomendaciones para un diseño
de tramarsa exitoso las cuales pueden
ser consultadas en varios libros
internet etcétera hoy en día existen
numerosos programas muchos de ellos
gratuitos que los diseñan
automáticamente basándose en criterios
termodinámicos y estructurales
el éxito de esta técnica depende del uso
de una adn polimerasa que no sea
desnaturalizada por los repetidos ciclos
de calentamiento esta enzima se aisló
originalmente de la bacteria termófila
termos acuáticos de ahí su nombre tag de
enea polimerasa y luego han ido
surgiendo diferentes variantes todas las
enzimas utilizadas poseen la actividad
de polimerasa 5 prima tres primas y
algunas poseen además actividad exo
nucleasa 5 prima 3 prima o actividad
exxon nuclear
3 prima 5 prima es decir actividad
correctora o profería las distintas
enzimas utilizadas poseen distintas
process y vida des tasas de error y
dejan distintos tipos de extremos
todas las adn polimerasas termoestables
requieren de cationes dehiba lentes para
su actividad en general magnesio y en
menor medida manganeso los cuatro tipos
de nucleótidos trifosfato adn tps y los
primers son capaces de interaccionar con
el magnesio por lo que la modalidad de
este último debe ser mayor que la
polaridad del grupo fosfato aportada por
los de ntp si primers de esta manera la
concentración óptima de magnesio debe
ser analizada empíricamente en cada caso
siendo un buen punto de partida 15
mínimo la clásicamente se utiliza un
buffer comercial que ya viene preparado
a veces este buffer puede atraer
incluido el magnesio y no hace falta
agregar aparte en la reacción
una típica reacción de pcr contiene
cantidades equipo lares 200 a 250 micro
molar de cada uno de los 4 de ntp s que
son las bases que va agregando la tag
polimerasa a medida que avanza la
reacción
la solución madre desde n tps debe estar
guardada a menos 20 grados en pequeñas
alícuotas para evitar repetidos ciclos
de congelado y descongelado
debido a la amplificación exponencial la
pcr es una técnica muy sensible que
permite detectar secuencias que se
encuentran mínimamente representadas en
una muestra por ejemplo se pueden
amplificar segmentos de adn humanos a
partir de las pocas células foliculares
que rodean a un solo pelo la pcr resulta
muy útil en el diagnóstico del adn en
otras palabras en la comprobación de la
presencia de un gen o de una mutación en
un gen específico oa nivel preparativo
en la amplificación de un segmento
determinado por este motivo la técnica
de pcr se usa para la detección de
enfermedades hereditarias la
identificación de huellas genéticas que
se usan mucho en el ámbito forense el
clonado de genes las pruebas de
paternidad y el diagnóstico de
enfermedades infecciosas como el co vida
desde la creación de la técnica de pcr
sus aplicaciones se multiplican día a
día y su gran versatilidad promete más y
nuevos usos en los más diversos campos
de la biología
y la medicina
ya vimos la teoría ahora vamos al
laboratorio virtual y vamos a ver cómo
sería el procedimiento de la pcr en la
práctica
luego de colocarnos todos los
instrumentos de protección tenemos que
preparar el área de trabajo con los
materiales que necesitaremos si no estás
familiarizado con los instrumentos del
laboratorio te recomiendo que veas
primero las partes 1 y 2 de los vídeos
de instrumentos de laboratorio al inicio
de esta serie
como es muy importante que la mezcla de
reacción no se contamine con ningún adn
que no sea el de interés puede
realizarse la primera parte del
procedimiento dentro de una cabina de
pcr que funciona con la misma lógica que
los flujos laminar es que vimos en la
segunda parte de los vídeos de
instrumentos de laboratorio dentro de la
cabina vamos a ubicar las pipetas
automáticas los racks con tips un
descarte para tirar los tips usados y
una gravilla con los tubos de los
reactivos y los tubos eppendorf vacíos
donde haremos la reacción de pcr
ya mencionamos antes cuáles son los
elementos necesarios para hacer la pcr
el buffer con magnesio la mezcla en
partes iguales de los cuatro de ntp s
los primers la tag polimerasa y la
muestra de adn que contiene el fragmento
que queremos amplificar que se llama adn
templado o molde
iremos repitiendo la cantidad
correspondiente de cada uno de estos
elementos dentro de un tubo de pendón
teniendo en cuenta que es importante
mezclar bien todos los reactivos antes
de pipe t ar generalmente se realiza lo
que se llama una master mix que es una
mezcla de reacción de mayor volumen para
evitar los errores de ppt o que generan
los volúmenes muy pequeños
esto sirve además cuando se hacen
duplicados o triplicados ya que asegura
que todos los tubos tengan exactamente
la misma cantidad de todos los reactivos
o cuando se quiere modificar una sola
variable manteniendo las demás
constantes en este caso será una master
mix con todos los elementos menos uno el
cual se agregará de forma individual y
diferenciada en cada uno de los tubos
individuales de reacción
aquí vemos un ejemplo de protocolo de
una pcr donde se indica la cantidad de
cada uno de los reactivos que tendrá
cada muestra individual tengamos en
cuenta que esto es sólo un ejemplo y que
cada reacción requiere una puesta a
punto donde pueden modificarse
diferentes variables en este ejemplo
también se calcula la cantidad de apipé
t ar para hacer una master mix que
permita generar 10 muestras siempre se
calcula un además por lo menos por el
error de pipe t o para que sobre un poco
una vez hecha la master mix se trasvasa
la cantidad de microlitros necesarios a
tubos de 0.2 mililitros para comenzar la
reacción el volumen final de reacción
suele ser entre 15 a 50 microlitros si
vamos a llenar muchos tubos o pósitos de
una placa con la misma master mix se
puede utilizar una pipeta multicanal en
este paso para optimizar el tiempo
cuando ya tenemos todos los tubos listos
se ubican dentro de un termociclador
como el que vimos en la segunda parte de
instrumentos de laboratorio se programa
de acuerdo al protocolo de amplificación
que queramos hacer y se comienza este es
un ejemplo de protocolo de amplificación
de 35 ciclos como vimos al principio
incluye la temperatura de
desnaturalización la temperatura de
annie link y la temperatura de extensión
además hay una incubación inicial que
asegura que todo el adn esté
desnaturalizado al comienzo de la
reacción y agregamos un segundo a 25
grados al final para que todas las
muestras bajen su temperatura
rápidamente cuando terminan los ciclos
esto es opcional
una vez terminada la pcr si todo salió
bien y el fragmento de interés estaba
presente en el adn templado tendremos
los tubos con millones de copias de ese
fragmento pero para poder visualizarlo
de alguna manera tenemos que continuar
con otra técnica la electroforesis en
gel de agarosa que veremos en el próximo
vídeo de esta serie
si este vídeo te sirvió para aprender o
comprender mejor este tema o si
simplemente te gustó por favor dale like
it' e invitó a suscribirte al canal para
poder tener a mano mucha más información
porque lo que sabes influencia tu
destino
[Música]
Voir Plus de Vidéos Connexes
Cómo Analizar Muestras de ADN para determinar Paternidad en Mamíferos
Distintos tipos de PCR's (PCR / RT-PCR / qPCR / RT-qPCR)
ELECTROFORESIS de ADN en GEL de AGAROSA [TEÓRICO y PRÁCTICO]
REGRESIÓN LINEAL MÚLTIPLE FACIL | SPSS | SUPUESTOS, CUÁNDO Y CÓMO USARLA (JERÁRQUICA, POR PASOS)
Aprende Como Un Niño con la Feynman Technique
The Plasmid Cloning Cycle
5.0 / 5 (0 votes)