Técnicas inmunológicas | Inmunofluorescencia
Summary
TLDREste video explica la técnica de inmunofluorescencia, una metodología de inmunoensayo que utiliza anticuerpos conjugados con flúoroforo. Se describen los métodos directos e indirectos, con énfasis en la alta sensibilidad del último. Se detalla el proceso de preparación de muestras, la utilización de microscopio de fluorescencia y confocal para visualizar la reacción. Además, se discuten los marcadores fluorescentes y su importancia en la visualización de la reacción. Se aplica la técnica para detectar enfermedades infecciosas y autoinmunes, destacando su relevancia en el diagnóstico de lupus eritematoso sistémico con nefropatía.
Takeaways
- 🔬 La inmunofluorescencia es una técnica de inmunoensayos que utiliza anticuerpos conjugados con un flúor para detectar antígenos o anticuerpos específicos.
- 🔍 Existen dos tipos de inmunofluorescencia: directa, donde el anticuerpo conjugado se une directamente al antígeno, y indirecta, que utiliza un segundo anticuerpo para aumentar la sensibilidad.
- 🏥 La inmunofluorescencia indirecta es más lenta pero más confiable, ya que permite la unión de múltiples anticuerpos secundarios a un solo anticuerpo primario.
- 🌟 Se requiere un microscopio especial para la inmunofluorescencia, ya que la muestra emitirá luz a una longitud de onda específica.
- 📚 El procedimiento de inmunofluorescencia en tejidos parafinadados es similar al de la inmunohistoquímica, incluyendo la exposición de antígenos, incubación con anticuerpos y lectura con un microscopio de fluorescencia o confocal.
- 💡 Los marcadores fluorescentes, como los isotiocianatos de fluoresceína y rodamina, son esenciales para visualizar la reacción en la inmunofluorescencia.
- 🔬 El microscopio confocal mejora la imagen en inmunofluorescencia al eliminar la luz de planos superiores e inferiores, permitiendo visualizaciones tridimensionales más nítidas.
- 👩⚕️ Las aplicaciones de la inmunofluorescencia son amplias, incluyendo el diagnóstico de enfermedades infecciosas, parasitarias, bacterianas, virales, fúngicas y autoinmunes.
- 🧬 La inmunofluorescencia indirecta es particularmente útil para la identificación de anticuerpos, como los anticuerpos anti nucleares en enfermedades autoinmunes.
- 🚫 La inmunofluorescencia indirecta puede dar falsos positivos y es cualitativa, lo que la hace menos confiable que técnicas cuantitativas como la ELISA.
- 📈 El caso clínico presentado ilustra cómo la inmunofluorescencia indirecta puede ser crucial para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico.
Q & A
¿Qué técnica se discute en el script del video?
-El script del video discute la técnica de inmunofluorescencia, que es una técnica de inmunoensayos que utiliza anticuerpos conjugados con un flúor.
¿Cuál es la diferencia entre la inmunofluorescencia directa e indirecta?
-La inmunofluorescencia directa implica que el anticuerpo conjugado se acopla directamente al antígeno de interés, mientras que la indirecta requiere un segundo anticuerpo, llamado anticuerpo puente, que se coloca entre el antígeno y el anticuerpo conjugado.
¿Qué ventajas y desventajas tiene el método indirecto de la inmunofluorescencia?
-El método indirecto de la inmunofluorescencia es más tardado pero ofrece mayor sensibilidad, lo que resulta en un resultado más confiable debido a que múltiples anticuerpos secundarios pueden acoplar a un solo anticuerpo primario.
¿Por qué se necesita un microscopio especial para la inmunofluorescencia?
-Se necesita un microscopio especial, como un microscopio de fluorescencia o confocal, para la inmunofluorescencia porque esta técnica implica la observación de un preparado que emite luz a una longitud de onda determinada.
¿Cómo se prepara el tejido para la inmunofluorescencia?
-El tejido se prepara con parafina, se corta con un microtomo, se pega al portaobjetos, se expone el antígeno mediante calor y se incuba con el anticuerpo primario y luego con el anticuerpo conjugado antes de la lectura con un microscopio.
¿Qué son los marcadores fluorescentes y cómo funcionan?
-Los marcadores fluorescentes son sustancias que permiten visualizar la reacción en la inmunofluorescencia. Funcionan absorbiendo una longitud de onda de luz, como los rayos ultravioleta, y emitiendo luz a una longitud de onda diferente.
¿Cuáles son los isotiocianatos de fluoresceína y de rodamina y cómo se diferencian?
-Los isotiocianatos de fluoresceína y de rodamina son flúoros comunes en la inmunofluorescencia. La fluoresceína se excita con luz azul y emite luz verde, mientras que la rodamina se excita con luz roja y emite luz amarilla.
¿Cómo ayuda el microscopio confocal a mejorar la imagen en la inmunofluorescencia?
-El microscopio confocal ayuda a mejorar la imagen eliminando la luz proveniente de planos superiores e inferiores al de interés mediante un diafragma focal llamado pino, lo que permite obtener imágenes tridimensionales más nítidas.
¿En qué aplicaciones se utiliza la inmunofluorescencia directa y indirecta?
-La inmunofluorescencia directa se utiliza en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, parasitarias, bacterianas, virales y fúngicas. La inmunofluorescencia indirecta, por otro lado, se utiliza para diagnosticar o monitorear enfermedades autoinmunes.
¿Qué es el lupus eritematoso sistémico y cómo se diagnostica con la inmunofluorescencia indirecta?
-El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune que se puede diagnosticar con la inmunofluorescencia indirecta al observar un patrón homogéneo de tinción en los núcleos con mitosis positiva en células de cerdo.
¿Cómo se relaciona la infección por citomegalovirus con el desarrollo de enfermedades autoinmunes?
-La infección por citomegalovirus puede desencadenar un proceso inmunológico que puede transformarse en un proceso autoinmune, lo que puede resultar en daño hepático y renal, y la generación de autoanticuerpos, como se vio en el caso clínico presentado en el script.
Outlines
🔬 Introducción a la Inmunofluorescencia
El primer párrafo introduce la técnica de inmunofluorescencia como una extensión de los inmunoensayos vistos anteriormente. Se describe cómo se utiliza anticuerpos conjugados con flúorofóres para detectar antígenos de interés. Se explican los métodos directos e indirectos, con sus respectivas ventajas y desventajas, y se menciona que el método indirecto ofrece mayor sensibilidad. Además, se contrasta con la inmunohistoquímica, señalando que la inmunofluorescencia requiere un microscopio especial para observar la luz emitida por los tejidos preparados. Finalmente, se describe el proceso de preparación de tejidos para esta técnica, desde la obtención de secciones delgadas hasta la lectura con un microscopio de fluorescencia o confocal.
📚 Procedimiento y Aplicaciones de la Inmunofluorescencia
El segundo párrafo detalla el procedimiento de la inmunofluorescencia, desde la preparación del tejido con parafina hasta la incubación con anticuerpos y la lectura con un microscopio. Se discuten los marcadores fluorescentes y sus propiedades, incluyendo el espectro de excitación y emisión de los isotiocianatos de fluoresceína y rodamina. Además, se explora el uso del microscopio confocal para obtener imágenes tridimensionales y se destacan las aplicaciones de la inmunofluorescencia en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, parasitarias y bacterianas, así como en la identificación de anticuerpos en enfermedades autoinmunes. Se ilustra con un ejemplo práctico la técnica de inmunofluorescencia indirecta para detectar anticuerpos anti nucleares.
🏥 Caso Clínico de Inmunofluorescencia en Diagnóstico
El tercer párrafo presenta un caso clínico que involucra el uso de la inmunofluorescencia indirecta en el diagnóstico de lupus eritematoso sistémico con nefropatía. Se describe la historia clínica de una paciente con síntomas como fiebre, adenopatías cervicales y signos de deterioro hepático y renal. Se narran los hallazgos de los exámenes de laboratorio, incluyendo la serología positiva para citomegalovirus y la prueba de Coombs directa positiva. Se discute cómo la inmunofluorescencia indirecta en células de cerdo reveló un patrón homogéneo con mitosis positiva, lo que sugiere la presencia de autoanticuerpos. Este resultado, junto con los síntomas y signos clínicos, llevó al diagnóstico definitivo de lupus eritematoso sistémico.
Mindmap
Keywords
💡Inmunofluorescencia
💡Anticuerpos conjugados
💡Inmunoensayos
💡Inmunofluorescencia directa e indirecta
💡Microscopio de fluorescencia
💡Fluor o foro
💡Isotiocianatos de fluoresceína y rodamina
💡Microscopio confocal
💡Enfermedades autoinmunes
💡Citomegalovirus
💡Lupus eritematoso sistémico
Highlights
La técnica de inmunofluorescencia utiliza anticuerpos conjugados con un flúor para detectar antígenos o anticuerpos específicos.
Existen dos tipos de inmunofluorescencia: directa y indirecta, con ventajas y desventajas distintas en cuanto a sensibilidad y rapidez.
El método indirecto de inmunofluorescencia es más sensible debido a la multiplicación de anticuerpos secundarios que se pueden unir a un anticuerpo primario.
La inmunofluorescencia requiere un microscopio especial para observar la emisión de luz por parte de los flúorescentes.
La técnica de inmunofluorescencia se puede aplicar a tejidos previamente preparados para inmunohistoquímica.
El procedimiento de inmunofluorescencia incluye la exposición de antígenos, incubación con anticuerpos y lectura con un microscopio de fluorescencia o confocal.
Los marcadores fluorescentes son esenciales para visualizar la reacción en la inmunofluorescencia, y varían en su longitud de onda de absorción y emisión.
El isotiocianatos de fluoresceína y el isotiocianatos de rodamina son dos de los flúocores más utilizados en la inmunofluorescencia.
El microscopio confocal mejora la calidad de la imagen al eliminar la luz de planos fuera de enfoque.
La inmunofluorescencia indirecta es especialmente útil para la identificación de anticuerpos en enfermedades autoinmunes.
La tinción homogénea de los núcleos con mitosis positiva es un patrón característico del lupus eritematoso sistémico en inmunofluorescencia indirecta.
La inmunofluorescencia indirecta puede arrojar falsos positivos y es cualitativa, a diferencia del ELISA que es cuantitativo y más sensible.
La inmunofluorescencia directa es utilizada en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, parasitarias, bacterianas, virales y fúngicas.
Un caso clínico complicado ilustra la aplicación de la inmunofluorescencia en el diagnóstico de lupus eritematoso sistémico con nefropatía.
La infección por citomegalovirus puede ser un factor desencadenante de enfermedades autoinmunes.
La prueba de Coombs directo positiva indica la presencia de autoanticuerpos y puede estar relacionada con pancitopenia.
El diagnóstico definitivo de lupus eritematoso sistémico se confirma con la inmunofluorescencia indirecta en células cerdos.
Transcripts
en el vídeo pasado ya vimos la técnica
de inmunohistoquímica ahora veremos otra
que igual pertenece a los inmunoensayos
la inmunofluorescencia la
inmunofluorescencia es una técnica que
utiliza anticuerpos unidos a un flúor o
foro mejor conocido como anticuerpo
conjugado y tal como lo vimos en el
vídeo pasado esta técnica se divide en
dos grupos la directa es donde el
anticuerpo conjugado se acopla al
antígeno de interés directamente y la
indirecta es donde hay un segundo
anticuerpo llamado anticuerpo puente
entre el antígeno de interés y el
anticuerpo conjugado las ventajas y
desventajas son las mismas
el método indirecto tiene la ventaja de
ser más rápido pero el menos sensible
mientras que el indirecto es más tardado
pero tiene alta sensibilidad es decir da
un resultado más confiable debido a que
múltiples anticuerpos secundarios se
pueden acoplar a un solo anticuerpo
primario así que tal como dije en el
vídeo anterior el método indirecto nos
vendrá mejor y a diferencia de la
inmunohistoquímica que como vimos una de
las técnicas más conocidas es el de
limón
y gaza la cual no requiere un
microscopio especial la
inmunofluorescencia como implica un
preparado que emitirá luz a una
determinada longitud de onda entonces si
necesita de un microscopio especial pero
también quiero que sepan que la
inmunofluorescencia se puede aplicar
también a tejidos preparados para
inmunohistoquímica el procedimiento será
el mismo ese se trata el tejido que
vamos a utilizar con parafina se corta
utilizando un micro tomo se pega al
portaobjetos se expone el antígeno
mediante el uso de calor se incuba la
preparación con el anticuerpo primario
contra el antígeno a detectar se lava y
se incuban nuevamente pero ahora con el
anticuerpo conjugado que llevara el
flúor o foro y se realiza la lectura con
ayuda de un microscopio de fluorescencia
o un microscopio confocal nuevamente y
como vimos en el vídeo pasado para
demostrar la presencia del antígeno que
nos interesa buscar necesitamos usar un
anticuerpo específico para dicho
antígeno y necesitamos un anticuerpo
secundario específico para dicho
anticuerpo para observar la reacción
hablemos de los marcadores fluorescentes
es
y las sustancias que nos permitirán
visualizar la reacción en esta imagen se
muestra el principio de la fluorescencia
se emite una determinada longitud de
onda como por ejemplo rayos ultravioleta
dicha longitud de onda será absorbida
por las partículas fluorescentes que son
las esferas naranja y éstas responderán
emitiendo luz a una longitud de onda
diferente a la que están recibiendo y
bueno para que no se me confundan el
flúor o foro y flúor o cromo no son lo
mismo es como decir dedo y mano el flúor
o foro es la parte del flúor o cromo que
hace posible la fluorescencia y hay
diferentes tipos de flúor o foros cada
uno trabajará a una longitud de onda
determinada los flúor o cromos más
utilizados son el isotiocianatos de
fluoresceína y el isotiocianatos de roda
mina en esta imagen pueden ver el
espectro de excitación representado con
línea continua mientras que el espectro
de emisión es demostrado con línea
punteada esto quiere decir que la luz
que emitirá el flúor o foro es
proporcional a la luz que le incide en
el por ejemplo la longitud de onda para
excitar la fluoresceína es de
aproximadamente 4
95 nanómetros perteneciente a la luz
azul y la luz que emite es de
aproximadamente 500 19 nanómetros
perteneciente a la luz verde que es el
color con el que vamos a ver la reacción
en cuanto a la roda mina la longitud de
onda para excitar lo es de 552
nanómetros y la luz que emite es de
aproximadamente 500 76 nanómetros
perteneciente a la luz amarilla ahora
vamos a hablar del microscopio el
microscopio utiliza una fuente de luz
visible es decir luz que comprende una
longitud de onda de entre 380 y 780
nanómetros y esta luz pasa por filtros
que permiten el paso de la luz
perteneciente a la longitud de onda que
nos interesa la luz incide mediante un
espejo dicroica que proyectará la luz
hacia donde se encuentra la preparación
para así lograr visualizar el flúor o
cromo utilizado en la preparación ahora
bien ya sabemos que el tejido que vamos
a utilizar en el caso de una
inmunohistoquímica por
inmunofluorescencia necesita ser delgado
mientras más delgado sea más nítida será
la imagen
con este método la imagen aún estando
enfocada se verá contaminada por
elementos que están tanto encima como
por debajo del campo enfocado
deteriorando así la imagen para que
entiendan a lo que me refiero con esto
supongamos que tú quieres tomar una foto
de los dos cubos estando en este punto
pero desde dicho punto sólo se puede
obtener una imagen en dos dimensiones
cuando en realidad tú la quieres ver en
tres para ello tienes que eliminar lo
que te está interfiriendo es decir el
cubo rojo para eso se creó el
microscopio confocal el microscopio
confocal funciona de esta manera primero
el microscopio confocal posee un
diafragma focal llamado pino en inglés
este pino elimina la luz proveniente de
planos inferiores o superiores es decir
elimina la luz proveniente de tanto
debajo como encima de lo que estamos
observando por eso dichos planos se
muestran en la imagen con línea punteada
por ello sólo se ilumina un punto en el
uso del microscopio confocal por lo que
para obtener imágenes tridimensionales
se requiere explorar toda la muestra es
decir enfocar tanto el plano
el cual estamos mirando como los dos
planos en línea punteada que el pino les
está eliminando para así obtener
diferentes flúor o foros que puedan
estar en un mismo punto de la muestra
tal y como se ven en la imagen ahora
volviendo a la técnica de
inmunofluorescencia las aplicaciones de
estas son muchas como dije necesitamos
anticuerpos específicos para el antígeno
del cual se sospecha en la muestra las
primeras aplicaciones de la
inmunofluorescencia utilizando muestra
de suero son las enfermedades
infecciosas causadas por bacterias como
lo es el caso de la sífilis por
parásitos como la toxoplasmosis o
virales como la influenza o la hepatitis
de igual manera que hice con el vídeo
anterior mostraré el procedimiento
detalladamente pero necesitamos el
planteamiento de un problema para que
esto sea más interactivo el más clásico
en el que se utiliza la
inmunofluorescencia puesto que hay
muchos vídeos en youtube hablando de
ella es en el que necesitamos observar y
cuantificar la presencia de anticuerpos
anti nucleares los cuales están
aumentados en pacientes con enfermedades
autoinmunes
como el lupus eritematoso o la artritis
autoinmune ojo mucho ojo no se me
confundan como dije queremos buscar
anticuerpos y no el antígeno para ello
necesitaremos un portaobjetos
conteniendo el sustrato antigénico de
los anticuerpos anti nucleares es decir
un portaobjetos multi pocillos con las
células cerdos si los anticuerpos
buscados se encuentran en el suelo se
unirán al sustrato antigénico del
portaobjetos y tras esto se les acoplar
a el anticuerpo con el flúor o foro es
decir el conjugado para que podamos
observar la reacción al microscopio
primero realizamos una dilución la más
habitual es 1 en 40 es decir 20
microlitros de muestra y 780 microlitros
de buffer pbs tomamos 10 o 20 micro
litros de los sueros problemas diluidos
y los colocamos en los pocillos
respectivos ocupamos por 30 minutos en
una cámara húmeda para favorecer la
reacción antígeno anticuerpo lavamos con
pbs y sumergimos la preparación en un
vaso kopplin conteniendo tves tras cinco
minutos removemos el pbs y año
uno nuevo esto es parte fundamental para
que la técnica se lleve a cabo
correctamente ahora se realiza otra
dilución con el anticuerpo conjugado es
decir el anticuerpo fluorescente de
acuerdo a la dilución que realizamos
previamente con el suero colocamos la
cantidad respectiva de conjugado en los
pocillos e incubamos en la cámara húmeda
nuevamente por 30 minutos lavamos
nuevamente con pbs colocamos el medio de
montaje ahora en este caso la
interpretación se realiza de acuerdo al
patrón que muestran las células se
reconocen tres grandes patrones nuclear
citoplasma tico y mitótico todas estas
imágenes muestran en dónde o en qué
parte de las células cerdos se ha
acoplado el anticuerpo que estábamos
buscando o también muestran si esa
proteína que nos interesa identificar
pertenece a un evento celular por lo que
tal como en la inmunohistoquímica la
inmunofluorescencia indirecta en el caso
de la identificación de un anticuerpo
permite también revelar tanto eventos
celulares como la localización de una
proteína es decir
un anticuerpo en el sustrato antigénico
y cada patrón de estos que ven en
pantalla arroja a una enfermedad
autoinmune en concreto pero se tiene que
buscar otros tipos de patrón en la
preparación para descartar otras
enfermedades y llegar a una sola la cual
se confirma con las manifestaciones
sintomatológicas y el historial clínico
del paciente pero la búsqueda de
anticuerpos anti nucleares por
inmunofluorescencia indirecta puede
arrojar falsos positivos es decir
podemos observar patrones en las células
que puedan significar una enfermedad
cuando en realidad no la hay y aparte
esta técnica es cualitativa cuando por
ejemplo la elisa es más cuantitativa y
más sensible es decir más confiable y
aparte es más rápida ahora si lo que
queremos es visualizar antígenos o bien
la estructura de una bacteria parásito
virus o cualquier microorganismo
infectante necesitamos en primera'
realizar una dilución de la muestra
problema si está muy cargada de antígeno
uno en cuarenta o uno en 80 fijamos con
formol lavamos añadimos el antiguo
primario dejamos incubar lavamos
añadimos el anticuerpo conjugado dejamos
incubar lavamos aplicamos el medio de
montaje y observamos al microscopio como
ven las aplicaciones de la
inmunofluorescencia directa en búsqueda
de antígenos son varias sobre todo en el
diagnóstico de enfermedades infecciosas
parasitarias bacterianas virales
fúngicas mientras que si buscamos
anticuerpos mediante inmunofluorescencia
indirecta
estaremos diagnosticando o al menos
monitoreando enfermedades autoinmunes
sin embargo esta técnica requiere de
material más sofisticado
veamos un caso clínico más complicado
que el del anterior vídeo paciente
femenino de 21 años que acude por
presentar fiebre de 38 grados la
exploración física revela adenopatías
cervicales abdomen doloroso a palpación
cervical
no hay mega lías ni masas en hipocondrio
si hay presencia de lesiones en labios y
deshidratación de mucosas tres semanas
después la paciente presenta un cuadro
gastrointestinal con diarrea líquida y
náuseas por lo que es trasladada a
urgencias se le realizan exámenes de
laboratorio la química sanguínea revela
creatinina transaminasas amilasa y
lactato deshidrogenasa elevadas en suero
el hemograma revela leucopenia y
trombocitopenia en análisis de orina se
revela una proteinuria con presencia de
cilindros granulosos y células renales
en sedimento en estudios inmunológicos
se revela serología positiva para el
citomegalovirus y negativa para el virus
epstein-barr también se le realizó una
prueba de coombs directo que dio
positiva se ingresa a la paciente para
esto
la causa del deterioro de parámetros
hepáticos y renales tras confirmar
infección por citomegalovirus se inició
tratamiento con ganciclovir tras
realizar carga viral y darse resultado
negativo se suspendió tratamiento con
ganciclovir a las dos semanas es
referido al laboratorio de autoinmunidad
donde se sospecha de enfermedad
autoinmune sistémica debido a los
parámetros hepáticos y renales sin
cambios durante su estancia en el
hospital para evaluar la naturaleza de
la posible enfermedad autoinmune se le
realizo inmunofluorescencia indirecta en
una lámina de células cerdos
observándose una tinción homogénea de
los núcleos con mitosis positiva bueno
en primera
evidentemente la paciente tenía una
infección por citomegalovirus y ya
sabemos que los primeros en actuar ante
una infección viral son los monocitos
los cuales están aumentados sin embargo
sólo es eso no afecta al recuento total
del euros pero a pesar de que muchos
asociamos la monocitos ys con el virus
de epstein-barr causante de la
mononucleosis infecciosa también hay
casos donde la mononucleosis se da en
infecciones por citomegalovirus
y bueno ahora saliendo nos de la
infección un poco puesto que ya se dio
por curada vayamos a las pruebas de
química sanguínea es evidente que ya hay
un daño hepático pero ojo también los
datos en las pruebas renales nos indican
que el riñón también sufrió daño y si
recuerdan en el vídeo donde hable del
diabetes una causa de las que se asocian
a lo mejor no tan a menudo es porque
había un proceso inmunológico que
terminó por transformarse en un proceso
autoinmune por lo que aunque las
enfermedades autoinmunes son de
etiología desconocida se ha propuesto a
los virus como candidatos potenciales y
también como dije en el vídeo donde di
la introducción a las anemias la prueba
directa de coombs cuando da positivo
quiere decir que hay auto anticuerpos y
no se puede tratar únicamente auto
anticuerpos contra los glóbulos rojos
aparte esto no quiere decir a fuerzas
que se trate de una anemia o una
hemólisis sino de también una
pancitopenia a lo que los
autoanticuerpos que la paciente está
comenzando a generar también son la
explicación de no sólo el cumplir ect o
positivo sino también de porque los
leuco si las plaquetas están bajos
ahora ya que confirmamos que la paciente
está generando auto anticuerpos y se
manifiestan por el daño hepático y renal
eso ya nos orienta de dónde está el
diagnóstico definitivo por lo que para
confirmar se requirió de la
inmunofluorescencia indirecta en células
cerdos en este caso las células arrojan
un patrón homogéneo con presencia de
mitosis perteneciente como vimos en el
cuadro al lupus eritematoso sistémico
así que el diagnóstico definitivo de la
paciente es lupus eritematoso sistémico
con nefropatía bueno esto ha sido todo
acerca de la inmunofluorescencia esperen
más vídeos sobre técnicas para detección
de proteínas muy pronto en este canal
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