Testing for COVID 19 using RT PCR

Medmastery

13 Jul 202010:04

Summary

TLDRيشرح هذا الفيديو كيفية تشخيص COVID-19 باستخدام اختبار RT-PCR، حيث يتم استخراج الحمض النووي الريبي من عينة المريض وتحويله إلى حمض نووي مكمل باستخدام الإنزيم العكسي لترانسكريبتاز. ثم يتم تكبير الحمض النووي باستخدام تفاعل البلمرة التسلسلي للكشف عن وجود RNA الفيروس. يتم قياس الحمل الفيروسي باستخدام قيمة عتبة الدورة (CT)، حيث يشير انخفاض قيمة CT إلى حمل فيروسي أعلى. على الرغم من دقة الاختبار، فإن حساسيته السريرية قد تكون أقل، مما يؤدي إلى احتمالية حدوث نتائج سلبية خاطئة بسبب عيوب في جمع العينات أو الطفرات الفيروسية.

Takeaways

😀 تشخيص كوفيد-19 يتطلب أخذ عينة من المريض باستخدام مسحة أنفية أو مسحة بلعومية أو عينة من اللعاب.
😀 تقنية RT-PCR تعتمد على استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) من العينة وتحويله إلى الحمض النووي (DNA) باستخدام إنزيم النسخ العكسي.
😀 تحويل RNA إلى DNA يتم لإنشاء DNA مكمل (cDNA)، والذي يمثل جميع الحمض النووي الريبي الموجود في العينة.
😀 يتم استخدام PCR للكشف عن cDNA الفيروسي الخاص بكوفيد-19 باستخدام برايمرات معينة تستهدف تسلسلًا فريدًا في الـ cDNA الفيروسي.
😀 عملية الـ PCR تتكون من ثلاث خطوات أساسية: التفكيك (Denaturation)، التمسك (Annealing)، والإطالة (Elongation)، وتكرر هذه الخطوات 40 مرة تقريبًا.
😀 مع تكرار الـ PCR، يتضاعف عدد الجزيئات الـ DNA في كل دورة، مما يتيح تكاثرًا ضخمًا للـ cDNA الفيروسي.
😀 في الـ RT-PCR، يتم إضافة مسبار يعطي إشارة فلورية عند تكوين جزيء DNA جديد، مما يسمح بمراقبة زيادة الحمض النووي الفيروسي في الوقت الحقيقي.
😀 قيمة دورة التفاعل (CT) تُستخدم لتحديد كمية الـ RNA الفيروسي في العينة، وكلما كانت القيمة أقل، كلما كان هناك حمل فيروسي أعلى.
😀 نتيجة RT-PCR الإيجابية تُعتبر مؤكدة إذا كانت قيمة CT أقل من 40، وتُعتبر قيمة CT مؤشرًا على درجة شدة المرض واحتمالية تطور الحالة.
😀 دقة اختبارات RT-PCR عالية جدًا من حيث الحساسية النوعية والسريرية، مما يعني أن النتائج الإيجابية غالبًا ما تكون دقيقة.
😀 المشاكل التي قد تؤدي إلى نتائج سلبية خاطئة تشمل التغيرات الطفرية في الفيروس، أساليب أخذ العينات غير الصحيحة، وكذلك نوع العينة وتوقيت جمعها.

Q & A

ما هو الاختبار المستخدم لتشخيص كوفيد-19؟
-يتم تشخيص كوفيد-19 عن طريق أخذ عينة من المريض عادة باستخدام مسحة من الأنف أو الحلق أو مؤخرًا باستخدام عينة من اللعاب، ثم اختبار وجود الحمض النووي الريبوزي الفيروسي باستخدام تقنية الـ RT-PCR.
كيف يعمل اختبار الـ RT-PCR؟
-في اختبار RT-PCR، يتم أولًا استخراج وعزل الحمض النووي الريبوزي من العينة. ثم يتم تحويل الحمض النووي الريبوزي إلى حمض نووي ريبوزي مكمل باستخدام إنزيم يسمى النسخ العكسي، ليتم بعد ذلك استخدام تقنية الـ PCR لتكثير الجزيئات المحددة من الحمض النووي المكمل.
ما هو دور الـ RT-PCR في تشخيص فيروس SARS-CoV-2؟
-يتم استخدام الـ RT-PCR للكشف عن الحمض النووي المكمل الخاص بفيروس SARS-CoV-2. يساعد هذا الاختبار في تحديد ما إذا كانت العينة تحتوي على RNA فيروسي، مما يدل على وجود الفيروس في العينة.
كيف يعمل التفاعل البلمريزي المتسلسل (PCR)؟
-يعمل PCR عن طريق ثلاث خطوات رئيسية: 1) التفكك الحراري للحمض النووي المزدوج، 2) تمهيد العوامل التي تتطابق مع تسلسل فريد في الـ cDNA الفيروسي، 3) إضافة إنزيم بوليميراز لإطالة السلسلة وتكثير الحمض النووي.
ما هو دور الـ CT أو عتبة الدورة في اختبار RT-PCR؟
-الـ CT هو عدد الدورات اللازمة لزيادة الإشارة الفلورية بشكل كبير عن مستوى الخلفية. يشير الـ CT المنخفض إلى وجود حمض نووي فيروسي أكثر في العينة، مما يعني أن المريض لديه حمولة فيروسية عالية.
ما هي العلاقة بين CT والقوة المرضية لكوفيد-19؟
-دراسات أظهرت أن المرضى الذين يعانون من مرض أكثر شدة يظهرون قيم CT منخفضة عند دخول المستشفى، مما يشير إلى حمل فيروسي أعلى. بينما المرضى الذين لديهم مرض أقل شدة يظهرون قيم CT أعلى.
كم من الوقت يستغرق اختبار RT-PCR عادة؟
-اختبار RT-PCR التقليدي يستغرق حوالي من ساعتين إلى أربع ساعات، بما في ذلك وقت استخراج وتحويل الحمض النووي الريبوزي إلى الحمض النووي المكمل. يمكن لبعض المعدات المتقدمة تقليص هذه المدة.
ما هي دقة اختبار RT-PCR في تحديد المرضى المصابين بكوفيد-19؟
-اختبار RT-PCR يمتاز بدقة عالية في تحديد المرضى المصابين بكوفيد-19، حيث أن لديه حساسية نوعية عالية تكاد تكون معدومة للأخطاء في النتائج الإيجابية. ومع ذلك، توجد نسبة من النتائج السلبية الخاطئة، ويعتمد ذلك على عدة عوامل مثل نوع العينة وطريقة جمعها.
ما هي الأسباب التي قد تؤدي إلى نتائج سلبية خاطئة في اختبار RT-PCR؟
-قد تنشأ النتائج السلبية الخاطئة بسبب عدة عوامل مثل الأخطاء في جمع العينة، أو النقل، أو التخزين غير السليم. كما أن تغيرات في تسلسل RNA الفيروسي أو الاختلافات بين مجموعات الاختبار يمكن أن تؤدي أيضًا إلى هذه المشكلة.
ما هو أهمية تقرير قيمة الـ CT في اختبار RT-PCR؟
-تقرير قيمة الـ CT مهم لأنه يساعد في تحديد حجم الحمولة الفيروسية في العينة، مما يعكس مدى شدة المرض والإصابة. على سبيل المثال، المريض الذي يظهر قيمة CT منخفضة لديه عدد أكبر من الجزيئات الفيروسية مقارنة بمريض يظهر قيمة CT أعلى.