DNeasy visual protocol

QIAGEN

29 Oct 201404:37

Summary

TLDREste video muestra cómo extraer ADN de alta calidad en solo 20 minutos utilizando los kits DNeasy Blood and Tissue de Qiagen. Diseñados para purificar rápidamente el ADN total de diversas muestras como tejidos animales, células, sangre, insectos y bacterias, estos kits no requieren extracción con fenol o cloroformo, ni precipitación con alcohol. El proceso comienza con la adición de proteinasa K y buffer, seguido de un proceso de centrifugación y lavado para purificar el ADN. El video también ofrece consejos para mejorar la eficiencia y rendimiento del proceso, y menciona la posibilidad de automatizar todo el procedimiento en la plataforma QIAcube.

Takeaways

🔬 El kit DNeasy Blood and Tissue está diseñado para purificar rápidamente el ADN total a partir de diversas muestras como tejidos animales, células, sangre, insectos y bacterias.
🌡️ No se requiere extracción con fenol o cloroformo, ni precipitación con alcohol, lo que simplifica el proceso de extracción del ADN.
🧪 Se suministran los buffers AW1 y AW2 como concentrados, y se deben diluir con etanol antes del uso.
💧 Se recomienda revisar los frasco de buffers AL y ATL para precipitados y, si los hay, redisolverlos.
🩸 Para muestras de sangre, se agrega proteinasa K a la muestra, luego se añade el buffer AL y se vortexea.
🔥 Se incuba la muestra de sangre durante 10 minutos a 56°C para facilitar la liberación del ADN.
🧊 Se añade etanol a la muestra para precipitar el ADN y se vortexea nuevamente.
🌀 Se utiliza una columna DNeasy Spin para purificar el ADN, eliminando los pasos de centrifugación y descarte de la solución intersticial.
⏱️ Se efectúa un segundo lavado con buffer AW2, que debe usarse a temperatura ambiente y离心ugado durante 3 minutos a alta velocidad para eliminar restos de etanol y sales.
🔋 Para obtener una mayor eficiencia en la extracción de ADN, se puede repetir el último paso de incubación y centrifugación.
📚 El ADN purificado está libre de inhibidores de la PCR, lo que permite su uso en técnicas sensibles como la PCR múltiplex, en tiempo real y secuenciación.

Q & A

¿Qué tipo de muestras se pueden utilizar con los kits de sangre y tejidos DN?
-Se pueden utilizar muestras de tejidos animales, células, sangre, insectos y bacterias.
¿Es necesario usar fenol o cloroformo en el proceso de extracción de ADN?
-No, el proceso no requiere extracción con fenol o cloroformo ni precipitación con alcohol.
¿Qué se debe hacer antes de usar los buffers aw1 y aw2 por primera vez?
-Antes de usar los buffers aw1 y aw2 por primera vez, se debe agregar la cantidad recomendada de etanol a las botellas.
¿Qué se debe hacer si hay precipitados en los buffers Al o ATL?
-Si hay precipitados en los buffers Al o ATL, se deben redisolver antes de continuar.
¿Cuál es el propósito de la proteina K en este protocolo?
-La proteina K se utiliza para lisar las células y liberar el ADN.
¿Qué se debe hacer para aumentar el rendimiento del ADN?
-Para aumentar el rendimiento de ADN, se puede reducir la cantidad de material inicial, extender el tiempo de incubación o aumentar la cantidad de proteina K.
¿Cuál es el propósito del centrifugado en este protocolo?
-El centrifugado se utiliza para separar el ADN del resto de los componentes en la muestra, permitiendo que el ADN quede en la columna de centrifugado.
¿Qué pasos se deben seguir para evitar la presencia de etanol y sales no deseados en la muestra final?
-Para evitar la presencia de etanol y sales no deseados, se debe descartar el flujo residual y centrifugar nuevamente durante un minuto más a 13,000 RPM.
¿Qué función tiene el buffer AE en el protocolo?
-El buffer AE se utiliza para eluir el ADN de la columna de centrifugado.
¿Cómo se puede obtener un mayor rendimiento de ADN durante la elución?
-Para obtener un mayor rendimiento de ADN, se puede repetir el último paso de elución para aumentar la eficiencia del proceso.

Outlines

00:00

🧬 Procedimiento de Extracción de ADN con DNeasy Blood and Tissue Kits

Este video presenta un protocolo visual para extraer ADN de alta calidad en solo 20 minutos utilizando los kits DNeasy Blood and Tissue de Qiagen. Los kits están diseñados para purificar rápidamente el ADN total a partir de diversas muestras, incluyendo tejidos animales, células, sangre, insectos y bacterias. No se requiere extracción con fenol o cloroformo, ni precipitación con alcohol. El contenido del kit incluye buffers AW1 y AW2, que deben diluirse con etanol antes del uso. Se describen los pasos para agregar proteinasa K y los buffers correspondientes a las muestras de sangre o tejido, y se detallan las pautas para incrementar la eficiencia de la extracción, como reducir la cantidad de material inicial, asegurar una lización completa de la muestra, y extender el tiempo de incubación o aumentar la cantidad de proteinasa K si es necesario. Se menciona la incubación de las muestras sanguíneas a 56°C y la posterior adición de etanol. El proceso continúa con la transferencia de la mezcla a un columna DNeasy Spin, la centrifugación y el descarte del flujo a través. Se describen los pasos para la limpieza del ADN con buffers AW1 y AW2, y se sugieren consejos para evitar el carry-over de etanol y sales. Finalmente, se extrae el ADN con buffer AE y se enfatiza la importancia de repetir el último paso para aumentar la eficiencia de la extracción. El video también menciona la compatibilidad del ADN purificado con la detección sensible en PCR, secuenciación y análisis múltiples, y la posibilidad de automatizar el proceso en el KayaCube, pudiendo procesar hasta 12 muestras simultáneamente. El manual DNeasy Blood and Tissue puede descargarse desde el sitio web de Qiagen.

Mindmap

Keywords

💡Extracción de ADN

La extracción de ADN es el proceso de aislar el material genético de un organismo para su análisis. En el vídeo, se muestra cómo realizar esta tarea en tan solo 20 minutos usando kits específicos diseñados para purificar el ADN total de diversas muestras, como tejidos animales, células, sangre, insectos y bacterias. Este concepto es central para el tema del vídeo, ya que todo el procedimiento descrito está enfocada en esta extracción eficiente y rápida.

💡Phenol y cloroformo

Phenol y cloroformo son solventes orgánicos que tradicionalmente se utilizan en la extracción de ADN para romper las células y separar el ADN de otras moléculas. El vídeo destaca que los kits presentados no requieren el uso de estos compuestos, lo que simplifica el proceso y reduce el riesgo de exposición química.

💡Precipitación con alcohol

La precipitación con alcohol es un método utilizado para purificar el ADN a través de la formación de precipitados. El vídeo menciona que no es necesario realizar este paso, lo que demuestra la simplicidad y eficiencia del método presentado.

💡Buffer AW1 y AW2

Los buffers AW1 y AW2 son componentes críticos en el proceso de extracción del ADN, ya que se utilizan para la limpieza y purificación del mismo. El vídeo indica que estos buffers se suministran como concentrados y deben diluirse con etanol antes de su uso, lo cual es un paso importante para preparar los reagentes necesarios para la extracción.

💡Proteinasa K

La proteinasa K es una enzima utilizada para degradar las proteínas en las muestras biológicas, lo que facilita la liberación del ADN. En el vídeo, se menciona que se agrega proteinasa K al inicio del proceso para ayudar en la disolución de las células y la exposición del ADN.

💡Vortex

Vortex es un término que se refiere a la agitación de las muestras para mezclar uniformemente los componentes. En el contexto del vídeo, se utiliza para asegurar que los compuestos y las muestras se mezclan adecuadamente, lo que es esencial para la eficacia de la extracción de ADN.

💡Incubación

La incubación es el proceso de mantener las muestras a una temperatura específica durante un período de tiempo para promover reacciones biológicas. En el vídeo, se menciona la incubación de las muestras sanguíneas a 56° C durante 10 minutos para mejorar la eficiencia de la extracción de ADN.

💡Columna DNeasy Spin

La columna DNeasy Spin es una herramienta clave en el kit de extracción de ADN, utilizada para separar el ADN de las impurezas y otros componentes de la muestra. El vídeo describe cómo pipetar la mezcla en la columna y luego centrifugarla para separar el ADN.

💡PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica ampliamente utilizada para amplificar segmentos específicos de ADN. El vídeo destaca que el ADN purificado con los kits descritos está libre de inhibidores de PCR, lo que permite su uso en análisis sensibles como la PCR múltiplex y la secuenciación.

💡Kaya Cube

El Kaya Cube es una plataforma de automatización que permite procesar múltiples muestras de ADN simultáneamente. El vídeo menciona que todos los pasos del protocolo visual pueden automatizarse en este dispositivo, lo que aumenta la eficiencia y la capacidad de procesamiento de muestras.

Highlights

Extract pure, high-quality DNA in just 20 minutes

DNeasy Blood and Tissue kits designed for quick DNA purification

Suitable for various sample sources including animal tissues, cells, blood, insects, and bacteria

No phenol or chloroform extraction required

No alcohol precipitation needed

Buffer AW1 and AW2 supplied as concentrates

Add recommended amount of ethanol to buffers before first use

Check for precipitates in buffer AL and ATL bottles and redissolve if present

Add proteinase K to the sample and vortex

Incubate blood samples for 10 minutes at 56°C

Add ethanol and vortex to increase DNA yield

Tips for reducing starting material and ensuring full lysis

Extend incubation time or increase proteinase K amount if pellet remains

Pipet mixture into DNeasy spin column and centrifuge

Discard flow-through and collection tube after centrifugation

Add buffer AW1 for the first wash step and centrifuge

Use buffer AW2 for the second wash step and centrifuge at 13,000 RPM

Avoid unwanted ethanol and salt carryover by discarding flow-through

Reuse collection tube and centrifuge further to ensure buffer AW1 is added before AW2

Buffer AW2 should be used at room temperature

Add buffer AE to spin column for DNA elution

Incubate at room temperature and centrifuge to extract DNA

Repeating the last step increases elution efficiency

Purified DNA is free from PCR inhibitors, suitable for sensitive detection and sequencing

All steps can be automated on the QIAcube for up to 12 samples simultaneously

Download DNeasy Blood and Tissue handbook from QIAGEN's website