Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - Biochemie - Labormethoden - AMBOSS Video
Summary
TLDRDie Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine molekularbiologische Methode zur Vervielfältigung von DNA-Abschnitten. Sie basiert auf der zellulären DNA-Replikation, wird aber in vitro durchgeführt. Durch den Einsatz von DNA-Polymerase und Primern, die die zu verlängernden DNA-Stränge angeben, werden spezifische DNA-Stücke exponentiell vervielfältigt. Die Prozessschritte beinhalten Denaturierung, Annealing und Elongation, die in mehreren Zyklen wiederholt werden. Die resultierende amplifizierte DNA kann für Analysen oder Anwendungen wie die Herstellung von therapeutischen Proteinen verwendet werden.
Takeaways
- 🔬 Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung bestimmter DNA-Abschnitte.
- 🌡️ PCR basiert auf den Mechanismen der zellulären DNA-Replikation und wird in vitro durchgeführt.
- 🔄 Die doppelsträngige DNA wird durch Hitze getrennt und anschließend mit Hilfe von DNA-Polymerase neu synthetisiert.
- 📈 Die Vervielfältigung erfolgt exponentiell durch wiederholte Reaktionszyklen.
- 🌡️ Die Temperaturzyklen bestehen aus Denaturierung (90°C), Annealing (50-60°C) und Elongation (70°C).
- 🧬 Die Reaktion benötigt Ausgangs-DNA, Nukleotide, eine hitzestabile DNA-Polymerase und zwei Primer.
- 🔬 Hitzestabile DNA-Polymerasen, wie die Taq-Polymerase, bleiben nach Erhitzung auf hohe Temperaturen funktionsfähig.
- 🔬 Primer sind kurze Oligonukleotide, die als Anknüpfungspunkte für die DNA-Polymerase dienen.
- 📈 Nach jedem Zyklus verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Moleküle, die dem gewünschten Abschnitt entsprechen.
- 🧫 Nach ca. 30 Zyklen kann das DNA-Fragment um den Faktor 10^6 bis 10^12 amplifiziert werden.
- 🔎 Die amplifizierte DNA kann mittels Gelelektrophorese analysiert und zur Detektion von Erreger-DNA verwendet werden.
- 🛠️ PCR wird auch für die Herstellung therapeutisch eingesetzter Proteine, wie rekombinantes Humaninsulin, genutzt.
Q & A
Was ist die Polymerasekettenreaktion (PCR)?
-Die Polymerasekettenreaktion, kurz PCR, ist eine Standardmethode der Molekularbiologie zur Vervielfaeltigung bestimmter Abschnitte doppelstraengiger DNA in vitro.
Wie basiert das Grundprinzip der PCR?
-Das Grundprinzip der PCR basiert auf den Mechanismen der zellulaeren DNA-Replikation, wobei die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufgespalten und anschließend von einer DNA-Polymerase neu synthetisiert wird.
Was ist das Ziel der PCR?
-Das Ziel der PCR ist es, einen spezifisch festgelegten DNA-Abschnitt exponentiell zu vervielfältigen, also zu amplifizieren.
Welche Rolle spielen die Primer in der PCR?
-Die Primer sind kurze Oligonukleotide, die als Anknüpfungspunkte für die DNA-Polymerase dienen und den zu amplifizierenden DNA-Abschnitt in beide Richtungen begrenzen.
Welche Art von DNA-Polymerase wird in der PCR verwendet?
-In der PCR wird eine hitzestabile DNA-Polymerase verwendet, wie zum Beispiel die Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus, die auch nach Erhitzung auf hohe Temperaturen noch funktionstüchtig ist.
Was geschieht in der Denaturierungsphase der PCR?
-In der Denaturierungsphase wird die Temperatur auf 90°C erhöht, was dazu führt, dass die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufspaltet.
Was ist die Annealing-Temperatur und welche Rolle spielt sie?
-Die Annealing-Temperatur liegt zwischen 50-60°C und ist die Temperatur, bei der die Primer sequenzspezifisch an die komplementären DNA-Sequenzen anlagern können.
Was passiert in der Elongationsphase der PCR?
-In der Elongationsphase wird die Temperatur auf etwa 70°C erhöht, die optimale Arbeitstemperatur der DNA-Polymerase, um die Nukleotide an die Primer anzuhängen und den neuen DNA-Strang zu synthetisieren.
Wie viele Nukleotide sind im Reaktionsansatz der PCR enthalten?
-Im Reaktionsansatz der PCR sind vier verschiedene Nukleotide enthalten: Desoxyadenosintriphosphat, Desoxyguanosintrisphosphat, Desoxycytidintriphosphat und Desoxythymidintriphosphat.
Was kann man mit der amplifizierten DNA nach der PCR machen?
-Die amplifizierte DNA kann in einer Gelelektrophorese visualisiert, weiter analysiert oder in ein Bakteriengenom transferiert werden, um beispielsweise therapeutisch eingesetzte Proteine herzustellen.
Was ist die Bedeutung der hohen Spezifität in der PCR?
-Die hohe Spezifität der PCR ermöglicht die Nachweisbarkeit auch von schwer oder gar nicht kultivierbaren Mikroorganismen und erhöht die Genauigkeit der Erkennung und Identifizierung von DNA-Abschnitten.
Outlines
🔬 PCR-Definition und Grundprinzip
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine molekularbiologische Methode zur Exponentiellen Vervielfältigung von DNA-Abschnitten. Sie basiert auf der zellulären DNA-Replikation, jedoch in vitro durchgeführt. Die doppelsträngige DNA wird durch Hitze getrennt, und DNA-Polymerase synthetisiert neue Tochterstränge. Die Vervielfältigung erfolgt durch Wiederholung dieser Prozesse, wobei sehr geringe Mengen an Ausgangs-DNA ausreichen, da die Reaktion hoch spezifisch ist und stark vervielfacht wird.
🧬 Detaillierter Ablauf der PCR-Reaktion
Der PCR-Reaktionsablauf beginnt mit der Aufnahme von Ausgangs-DNA, Nukleotiden, einer hitzestabilen DNA-Polymerase wie der Taq-Polymerase und zwei Primern. Die Reaktion umfasst mehrere Zyklen, die aus der Denaturierung der DNA bei 90°C, dem Annealing der Primer bei 50-60°C und der Elongation bei ca. 70°C bestehen. Jeder Zyklus verdoppelt die DNA-Menge, wobei die Anzahl der ursprünglichen langen DNA-Moleküle im Verhältnis zu den gewünschten Produkten gering bleibt, da diese exponentiell wachsen.
🌟 Anwendung und Analyse der amplifizierten DNA
Die durch PCR amplifizierte DNA kann für verschiedene Analysen verwendet werden, wie die Identifizierung von Erreger-DNA mittels Gelelektrophorese. Die hohe Spezifität der PCR erlaubt die Nachweisbarkeit von Mikroorganismen, die schwer oder nicht kultivierbar sind. Darüber hinaus kann die DNA auch in ein Bakteriengenom transferiert werden, um therapeutisch eingesetzte Proteine wie rekombinantes Humaninsulin herzustellen.
Mindmap
Keywords
💡Polymerasekettenreaktion
💡DNA-Replikation
💡DNA-Polymerase
💡Denaturierung
💡Annealing
💡Elongation
💡Primer
💡Amplifikation
💡Gelelektrophorese
💡Rekombinantes Humaninsulin
Highlights
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Standardmethode in der Molekularbiologie zur Vervielfältigung von DNA-Abschnitten.
PCR basiert auf den Mechanismen der zellulären DNA-Replikation, jedoch in vitro durchgeführt.
Die doppelsträngige DNA (Template) wird durch Hitze getrennt, um Einzelstränge zu erzeugen.
DNA-Polymerase synthetisiert neue Tochterstränge von der Einzelstrang aus.
Die Reaktion wird exponentiell durch Wiederholungen vervielfältigt, was eine starke Amplifikation ermöglicht.
Kleine Mengen an Ausgangs-DNA sind für die Amplifikation ausreichend, da die Reaktion hoch spezifisch ist.
Der Reaktionsansatz enthält vier verschiedene Nukleotide als Bausteine für die DNA.
Eine hitzestabile DNA-Polymerase, wie die Taq-Polymerase, wird verwendet, die nach Erhitzung noch funktionstüchtig bleibt.
Zwei verschiedene Primer werden verwendet, um die DNA-Polymerase an die passenden Stellen zu binden.
Die Reaktionsabläufe bestehen aus Denaturierung, Annealing und Elongation.
Die Temperatur wird in jedem Zyklus gezielt erhöht und verringert, um DNA-Strang zu trennen und neue zu synthetisieren.
Nach dem ersten Reaktionszyklus verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Stränge.
Mit jedem Zyklus nimmt die Anzahl der DNA-Moleküle exponentiell zu.
Nach ca. 30 Zyklen kann das DNA-Fragment um den Faktor 10^6 bis 10^12 amplifiziert werden.
Die amplifizierte DNA kann mittels Gelelektrophorese visualisiert und analysiert werden.
PCR ermöglicht die Nachweisbarkeit von Erreger-DNA und die Identifizierung von Mikroorganismen, die schwer oder nicht kultivierbar sind.
Die Methode findet Anwendung in der Herstellung therapeutisch eingesetzter Proteine wie rekombinantes Humaninsulin.
Transcripts
PCR
Definition Die Polymerasekettenreaktion, kurz PCR, fuer
Englisch polymerase chain reaction, ist eine Standardmethode der Molekularbiologie zur
Vervielfaeltigung bestimmter Abschnitte doppelstraengiger DNA.
Grundprinzip Die PCR beruht auf den Mechanismen der zellulaeren
DNA-Replikation, wird aber in vitro durchgefuehrt.
Das Grundprinzip ist dabei relativ simpel: Zuerst wird die doppelstraengige DNA, das
so genannte Template, durch Hitze getrennt.
Anschliessend synthetisiert eine DNA-Polymerase an jedem Einzelstrang in jeweils eine Richtung
einen neuen Tochterstrang.
Durch mehrfache Wiederholungen dieser Reaktionen wird ein spezifisch festgelegter DNA-Abschnitt
exponentiell vervielfaeltigt, d.h. amplifiziert.
Schon sehr kleine Mengen Ausgangs-DNA genuegen fuer die erfolgreiche Amplifikation des gewuenschten
DNA-Abschnitts, da die Reaktion hoch spezifisch ablaeuft und eine sehr starke Vervielfaeltigung
stattfindet.
Detaillierter Ablauf Wie funktioniert der Reaktionsablauf im Detail?
Zu Beginn des ersten Reaktionszyklus’ enthaelt der Reaktionsansatz folgendes:
Doppelstraengige Ausgangs-DNA Vier verschiedene Nukleotide als Bausteine
der DNA - das sind im Einzelnen Desoxyadenosintriphosphat
Desoxyguanosintrisphosphat Desoxycytidintriphosphat und
Desoxytymidintriphosphat DNA-Polymerase
Hier verwendet man eine besondere, naemlich hitzestabile DNA-Polymerase.
Sie ist auch nach dem Erhitzen auf hohe Temperaturen, die zur Denaturierung der DNA notwendig sind,
noch funktionstuechtig.
Solche Polymerasen stammen aus thermophilen Bakterien, z.B.
Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus.
Und schliesslich enthaelt der Reaktionsansatz noch zwei verschiedene sogenannte Primer.
Das sind zwei kurze Oligonukleotide unterschiedlicher Nukleotidsequenz, die der DNA-Polymerase als
Anknuepfungspunkt fuer das naechste passende Nukleotid dienen.
Jeder der Primer begrenzt den einen der zu amplifizierenden DNA-Straenge in eine Richtung.
Die Reaktion laeuft folgendermassen ab:
Denaturierung Die Temperatur wird zuerst auf 90°C erhoeht,
wodurch die DNA denaturiert und sich in Einzelstraenge auftrennt.
Annealing Im naechsten Schritt wird die Temperatur auf
die sogenannte Annealing-Temperatur von 50-60°C gesenkt.
Jetzt koennen sich die Primer an die komplementaeren DNA-Sequenzen anlagern.
Elongation In der nun folgenden Elongationsphase wird
die Temperatur wieder auf ca.
70°C erhoeht.
Dies ist die optimale Arbeitstemperatur der DNA-Polymerase, bei der sie die Nukleotide
an die Primer anhaengt.
Jeder Primer wird immer nur an seinem 3’OH-Ende verlaengert, dem Anknuepfungspunkt fuer das
naechste, komplementaere Desoxyribonukleotid.
Im ersten Reaktionszyklus erhaelt man noch zwei zu lange DNA-Straenge, die jeweils auf
einer Seite ueber den gewuenschten Abschnitt hinausgehen.
Das zu amplifizierende DNA-Fragment liegt jetzt insgesamt viermal vor.
Es wurde also verdoppelt.
Im zweiten Reaktionszyklus wird die Temperatur zuerst wieder auf 90°C erhoeht ((Denaturierung)).
Die im Reaktionsgemisch vorhandenen doppelstraengigen DNA-Molekuele denaturieren.
Im folgenden Schritt wird die Temperatur wieder auf die Annealing-Temperatur gesenkt.
Die Primer lagern sich sequenzspezifisch an ((Annealing)).
Im folgenden Schritt synthetisiert die DNA-Polymerase wieder die komplementaeren DNA-Straenge bei
ihrer Arbeitstemperatur von ca.
70°C ((Elongation)).
Nach dem zweiten Reaktionszyklus wurde wiederum die im Reaktionsgemisch vorhandene DNA verdoppelt.
Jetzt finden sich auch schon zwei DNA-Molekuele, die in ihrer Laenge genau dem zu amplifizierenden
DNA-Abschnitt entsprechen.
Im dritten Reaktionszyklus verdoppelt sich die vorhandene DNA-Menge wieder nach dem gleichen
Ablauf: Denaturierung, Annealing, Elongation.
Mit jedem weiteren Zyklus der PCR erhaelt man immer mehr DNA-Molekuele, die dem gewuenschten
Abschnitt auf der Ausgangs-DNA entsprechen.
Im Verhaeltnis ist die Anzahl der anfaenglich noch zu langen DNA-Molekuele verschwindend
gering, denn ihre Anzahl steigt nur linear an, wohingegen die Menge der Produkte mit
der gewuenschten Laenge exponentiell waechst.
Nach ca.
30 Zyklen wurde das durch die Wahl der Primer festgelegte DNA-Fragment je nach Effizienz
der Reaktion um den Faktor 106 bis 1012 amplifiziert.
Weitere Verwendung/Analyse Die amplifizierte DNA kann jetzt analysiert
werden.
Dazu wird diese meist in einer Gelelektrophorese sichtbar gemacht.
So kann z.B. eine mittels PCR vervielfaeltigte Erreger-DNA nachgewiesen werden.
Dank der hohen Spezifitaet der Reaktion ist es moeglich, auch schwer oder gar nicht kultivierbare
Mikroorganismen nachzuweisen.
Alternativ kann die DNA auch weiterverwendet und z.B. in ein Bakteriengenom transferiert
werden.
Diese gentechnische Methode wird verwendet, um bestimmte, therapeutisch eingesetzte Proteine
herzustellen, z.B. rekombinantes Humaninsulin.
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