Sistem CRISPR/Cas9 untuk Pemuliaan Tanaman
Summary
TLDRThe script delves into the CRISPR-Cas9 gene-editing technology, highlighting its origin in bacterial immune systems and its evolution into a versatile tool for precise genetic manipulation. It covers the components of the CRISPR-Cas9 system, the design process for targeting DNA sequences, and the technical stages of applying this system in plant breeding. This includes constructing the system, transformation into plant cells, regeneration, screening, and validation to ensure the edited plants are free from unwanted DNA and exhibit the desired phenotypes.
Takeaways
- 🧬 The CRISPR-Cas9 system is a gene-editing technology derived from a bacterial immune system used to combat viral infections.
- 🔎 CRISPR-Cas9 is highly specific, allowing for the recognition of target DNA sequences through the guide RNA and the Cas9 enzyme.
- 🔋 The Cas9 enzyme is an RNA-guided DNA endonuclease that can be sourced from various bacterial species.
- 📜 The guide RNA (gRNA) is synthetic and around 100 nucleotides long, with two ends that bind to the target DNA sequence.
- 🔗 The gRNA's 20-nucleotide sequence at the 5' end is crucial for binding to the target DNA, which must include a PAM (protospacer adjacent motif).
- ✂️ The Cas9 enzyme cuts double-stranded DNA, creating a double-strand break at the target site, initiating the editing process.
- 🛠️ Two main repair mechanisms follow the DNA cut: non-homologous end joining (NHEJ), which can introduce random mutations, and homology-directed repair (HDR), which uses a template for precise edits.
- 🌱 The application of CRISPR-Cas9 in plant breeding involves constructing the system, designing the target recognition, transforming the plant cells, and regenerating the edited plants.
- 🧬 The construction of the CRISPR-Cas9 system includes creating the Cas9 protein and the gRNA with a promoter for expression in the plant cells.
- 🔬 Screening and validation techniques such as gel electrophoresis and next-generation sequencing are used to detect and confirm the genetic modifications.
- 🌟 The ultimate goal is to produce genetically edited plants with desired phenotypes, free from any foreign DNA and with stable genetic traits.
Q & A
What does CRISPR stand for?
-CRISPR is an acronym for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats.
What is the original purpose of the CRISPR system in bacteria?
-The original purpose of the CRISPR system in bacteria is to defend against viral infections as an adaptive immune system.
How does the CRISPR-Cas9 system achieve high specificity in targeting DNA sequences?
-The CRISPR-Cas9 system achieves high specificity through the guide RNA (gRNA) that can recognize a specific DNA sequence adjacent to a PAM (protospacer adjacent motif) site.
What are the two main components of the CRISPR-Cas9 system?
-The two main components of the CRISPR-Cas9 system are the Cas9 enzyme and the guide RNA (sgRNA).
From which bacteria can the Cas9 enzyme be sourced?
-The Cas9 enzyme can be sourced from various bacteria such as Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus thermophilus, and Brevibacillus laterosporus.
What is the role of the guide RNA (gRNA) in the CRISPR-Cas9 system?
-The guide RNA (gRNA) in the CRISPR-Cas9 system serves as a sequence guide to identify the specific DNA sequence to be edited.
What is the function of the tracrRNA in the CRISPR-Cas9 system?
-The tracrRNA (trans-activating crRNA) forms a complex with the gRNA and Cas9 enzyme, which then recognizes and cleaves the target DNA sequence.
What are the two main repair mechanisms following DNA cleavage by CRISPR-Cas9?
-The two main repair mechanisms following DNA cleavage by CRISPR-Cas9 are Non-Homologous End Joining (NHEJ) and Homology Directed Repair (HDR).
How is the CRISPR-Cas9 system applied in plant breeding?
-The CRISPR-Cas9 system is applied in plant breeding through a process that includes constructing the CRISPR-Cas9 system, designing the target DNA sequence, transforming the system into plant cells, and then regenerating and screening the edited plants.
What is the purpose of the screening process in CRISPR-Cas9 edited plants?
-The screening process in CRISPR-Cas9 edited plants is to identify and select plants that have undergone the desired genetic modifications.
How can the success of CRISPR-Cas9 integration be verified in plants?
-The success of CRISPR-Cas9 integration can be verified in plants through techniques such as PCR amplification followed by electrophoresis to check for the presence of expected DNA fragments, mismatch cleavage assays, and sequencing analysis.
Outlines
🧬 Introduction to CRISPR-Cas9 Technology
The first paragraph introduces CRISPR-Cas9 as a revolutionary gene-editing tool derived from a bacterial immune system. It explains the high specificity of the system due to the guide RNA (gRNA) that targets the DNA sequence for editing. The Cas9 enzyme, sourced from various bacteria, is highlighted along with its role in cutting the DNA strand. The paragraph also describes the components of the CRISPR-Cas9 system, including the Cas9 protein and the synthetic single-guide RNA (sgRNA), which guides the enzyme to the target DNA sequence. The sgRNA has a 20-nucleotide sequence that pairs with the target DNA, and the system's ability to create a double-strand break in DNA is discussed, as well as the subsequent repair mechanisms.
🌱 CRISPR-Cas9 in Plant Breeding: Process and Mechanisms
The second paragraph delves into the application of CRISPR-Cas9 in plant breeding, outlining the four main stages of the process: construction of the CRISPR-Cas9 system, design and targeting, transformation into plant cells, and regeneration and screening of genetically modified plants. It discusses two repair mechanisms following DNA cleavage: non-homologous end joining (NHEJ), which can introduce random mutations, and homology-directed repair (HDR), which uses a template for precise editing. The paragraph also touches on the technical steps involved in designing the CRISPR-Cas9 system and the various techniques for plant transformation, such as Agrobacterium-mediated transformation, protoplast, or particle bombardment.
🛠️ Constructing the CRISPR-Cas9 System for Plant Genome Editing
The third paragraph focuses on the construction of the CRISPR-Cas9 system, detailing the assembly of the Cas9 enzyme and sgRNA within a vector, each with its promoter. It describes the artificial synthesis of sgRNA and the integration of the CRISPR-Cas9 system into the plant genome. The paragraph explains the design of the CRISPR-Cas9 system to target specific DNA sequences and the subsequent integration and transformation processes, which can be achieved through various methods such as Agrobacterium, electroporation, or particle bombardment. The importance of regeneration and screening for successful genome editing is also emphasized.
🔬 Screening and Validation of CRISPR-Cas9 Edited Plants
The fourth paragraph discusses the screening and validation process for plants edited with the CRISPR-Cas9 system. It describes initial phenotypic screening and further molecular detection using gel electrophoresis to identify mutated plant lines. The use of mismatch cleavage detection assays to estimate the editing efficiency and the role of next-generation sequencing for comprehensive sequence analysis are highlighted. The paragraph also addresses the need for further analysis to ensure the absence of unwanted DNA from the transformation process and to evaluate the stability and desired phenotype of the genetically modified plants.
Mindmap
Keywords
💡CRISPR-Cas9
💡Gene Editing
💡Bacterial Immune System
💡sgRNA (Single Guide RNA)
💡Cas9 Enzyme
💡PAM Sequence
💡Transformation
💡Regeneration
💡Screening
💡Homology-Directed Repair (HDR)
💡Non-Homologous End Joining (NHEJ)
Highlights
CRISPR-Cas9 is a gene-editing technology derived from a bacterial immune system used to combat viral infections.
The CRISPR-Cas9 system is highly specific, allowing for precise targeting of DNA sequences for editing.
The Cas9 enzyme is sourced from various bacteria, including Staphylococcus aureus and Streptococcus thermophilus.
Single-guide RNA (sgRNA) is a synthetic RNA molecule that guides the Cas9 enzyme to the target DNA sequence.
The sgRNA has a 20-nucleotide sequence that pairs specifically with the target DNA sequence, including a PAM motif.
The CRISPR-Cas9 complex can cause double-strand DNA breaks, facilitating targeted gene editing.
Two main repair mechanisms follow DNA cleavage: non-homologous end joining (NHEJ) and homology-directed repair (HDR).
NHEJ can introduce random mutations, while HDR uses a template for precise edits, often referred to as genome editing scissors.
The CRISPR-Cas9 system can be constructed using vectors with promoters for each component.
Design of the CRISPR-Cas9 system involves creating a 20-nucleotide spacer sequence for specific target recognition.
Transformation techniques for plant cells include Agrobacterium-mediated, protoplast, or particle bombardment methods.
Regeneration of transformed plant cells allows for the growth of genetically edited plants.
Screening and validation of genetically edited plants involve gel electrophoresis and sequence analysis.
Next-generation sequencing can be used for comprehensive analysis of the edited genome.
Further analysis is required to ensure plants are free from Agrobacterium DNA and exhibit the desired phenotype.
The CRISPR-Cas9 system has four main stages in plant breeding: construction, design, transformation, and regeneration, screening, and validation.
Mismatch cleavage detection is used to estimate the percentage of edited cells in the population.
The CRISPR-Cas9 system has significant practical applications in plant breeding for creating genetically modified plants.
Transcripts
[Musik]
kmungkinan teknik selanjutnya adalah
Christopher ke-9 crisper merupakan
singkatan dari Cluster regularly
interspectin palindromic repeat awalnya
sistem ini digunakan or pada bakteri
streptokokus dan neisseria untuk melawan
infeksi virus sebagai bentuk sistem imun
adaptif dalam sel bakteri lalu dalam
perkembangannya sistem ini kemudian
diadopsi secara luas dalam teknologi
editing denom karena efisiensi
kesederhanaan aplikasi dan juga
fleksibilitasnya spesifitas target dalam
sistem crispr cas9 sangat tinggi karena
Sisi target JNE dapat dikenali melalui
model dan awas
Hey dan Sisi yang tidak ditarget atau of
target site dapat diidentifikasi melalui
analisis sekuens
Hai komponen utama dari sistem crispr
cas9 terdiri dari dua unit penting yang
pertama adalah kesembilan Kemudian yang
kedua adalah single Kids Erna atau
disingkat SG Erna ke-9 adalah enzim DNA
endonuklease yang umumnya dapat diambil
dari beberapa jenis bakteri seperti
brevibacillus laterosporus
Staphylococcus aureus Streptococcus
thermophilus dan streptokokus pyogenesis
pada gambar protein enzim dari
kesembilan ini adalah yang memiliki
bentuk seperti roti kemudian komponen
yang kedua adalah single gaib Erna atau
disingkat SG Erna single Garena
ini merupakan Erna sintetis dengan
panjang sekitar 100 nukleotida ada dua
ujung yakni dua Pucung masing-masing
ujung 5 dan juga ujung tiga pada ujung 5
memiliki sekuens sepanjang 2000 tidak
yang merupakan atau disebut sebagai crna
sekuens ini memiliki peran sebagai
sekuens pemandu untuk mengidentifikasi
sekuens target yang diiringi dengan
Square foto Special Edition motif atau
pump yang sering memiliki konsensus
n-gage dimana n merupakan nukleotida
apapun sedangkan G merupakan basa guanin
jika melihat digambar crna ini adalah
yang
Nike warna merah dimana dia nanti akan
mentarget sekuens spesifik dari DNA yang
akan kita edit kemudian bagian yang
kedua dari single-case RNA atau SG Erna
adalah struktur melingkar atau yang
berbentuk lu pada ujung tiga yang
disebut sebagai Treasure RNA yang dapat
berikatan dengan sequence Erna sehingga
membentuk kompleks dengan g9 yang akan
memotong DNA untai ganda serta membentuk
pemotongan untuk ganda di sisi ini jika
digambar teman-teman bisa lihat yang
warnanya biru di gambar nomor satu
kemudian protein yang telah membentuk
kompleks dengan
yoghurt Erna atau sgr enak ini nanti
akan mengenali DNA target kita kalau
pada gambar nomor 2 ini DNA target kita
divisualisasikan sebagai your favorite
jin di mana disampingnya ada sekuen spam
yang merupakan sekuens yang bisa
dikenali oleh kompleks antara Erna
dengan protein k9 ini kemudian setelah
nanti akan berikatan dengan sekuens DNA
targetnya akan mengalami pemotongan atau
KTP setelah itu proses reparasinya atau
proses pes-nya akan difasilitasi oleh
suatu mekanisme yang disebut sebagai
nonhomolog ghost and joining proses
reparasi ini merupakan salah
dari dua jenis mekanisme reparasi tas
Hai mengulang sedikit tentang prinsip
kerja yang penting dalam sistem crispr
cas9 yang pertama adalah protein enzim
kesembilan endonuklease harus mampu
mengenali sekuens pendek yang berdekatan
dengan sekuens target yakni sekuen spam
kemudian SG Erna akan membentuk kompleks
Erna protein atau ribonucleoprotein
dengan protein enzim kesembilan
Indonesia yang kemudian akan masuk ke
nukleus lalu mampu mengenali sekuens
target yang spesifik sehingga membentuk
Hybrid dengan sekuens target ketika
saling terkait atau berikatan maka
protein kesembilan akan memutus untai
ganda DNA saat untai terputus sel dapat
memperbaiki nya melalui mekanisme
perbaikan atau reparasi
jalur mekanisme perbaikan bisa melalui 2
Cara yang pertama adalah non homologous
and joining Kemudian yang kedua adalah
homologi directed by combination of
G2 mekanisme reparasi yang telah
disebutkan sebelumnya memiliki
karakteristik tertentu nonhomolog
go-send joining atau nhj terjadi mutasi
secara acak atau random dimana nanti
akan mengarahkan terjadinya delesi dan
insersi terhadap urutan DNA yang
diprogram kemudian untuk jalur reparasi
HDR atau homologi deret River mutasi
diarahkan oleh suatu template atau
cetakan dimana mekanisme ini juga sering
disebut sebagai perisai genom editing a
Hai tahapan teknis dari aplikasi sistem
crispr cas9 dalam program pemuliaan
tanaman terdiri dari empat tahap utama
yang pertama adalah konstruksi sistem
ke-9 dan SG Erna dimana konstruksinya
bisa dilakukan masing-masing terlebih
dahulu menggunakan vektor kemudian tahap
yang kedua adalah desain sistem crispr
cas9 dalam konstruk Factor kemudian
tahap yang ketiga setelah Factor
terbentuk yang didalamnya mengandung
sistem crispr cas9 siap dilakukan
transformasi ke dalam sel tanaman
beberapa jenis teknik transformasi bisa
menggunakan agrobacterium atau
undakan protoplas atau bisa juga dengan
menggunakan partikel bombardment
kemudian setelah dilakukan transformasi
ke dalam sel tanaman dilakukan
regeneration agar Celta namanya mampu
tumbuh kemudian setelah itu dilakukan
skrining atau penapisan juga validasi
tanaman transgenik yang dihasilkan pada
tahap ini ada beberapa teknik yang bisa
dilakukan yakni menggunakan
elektroforesis gel untuk sistem deteksi
dan skrining nya kemudian bisa juga
proses validasinya menggunakan analisis
sekuens entah itu analisis sekuens yang
berdasarkan pada metode sanger atau
menggunakan metode yang lebih terkini
yakni next-generation sekuensing setelah
ini
tetap juga dibutuhkan analisis yang
lebih jauh untuk mendapatkan tanaman
yang bebas dari ddna agrobacterium dan
juga untuk mendapatkan tanaman dengan
fenotip yang diinginkan sehingga fenotip
dari tanaman transgenik tersebut juga
harus terus dievaluasi
Hai Mari kita ke penjelasan detil dari
masing-masing tahap pada teknik aplikasi
sistem crispr cas9 untuk menghasilkan
tanaman transgenik dalam program
pemuliaan tanaman detil tahapan yang
pertama adalah tentang konstruksi sistem
ke-9 dan SG Erna untuk menghasilkan
sistem crispr cas9 pada tahap ini
masing-masing komponen dari sistem
tersebut yakni d9 dan SG Erna
dikonstruksi dalam sebuah vektor yang
masing-masing memiliki promotor jadi
promotor juga dipasang pada vektor
tersebut sehingga dihasilkan sistem ke-9
dan juga SG Erna untuk SG arena sendiri
dilakukan fuzzy secara artifisial antara
veterna dan juga crna kemudian setelah
sistem crispr cas9 dibuat dilakukan
desain sistem crispr cas9 dalam konstruk
Factor yang didalamnya mengandung cc
pengenalan target dari DNA kita jadi
umumnya silkway spenser ini memiliki
panjang 20 nukleotida yang berikatan
secara spesifik dengan sekuens target
yang mengandung motif pump pada ujung
tiga kemudian SG Erna akan membentuk
struktur batang lingkaran Erna yang
berikatan dengan enzim ke-9 pada tahap
ini terjadi integrasi sgr naga9 dengan
sekuens yang komplemen dengan target
dalam
setan Jadi kalau pada tab yang pertama
itu baru ke-9 dan sgr enaknya terlebih
dahulu pada tahap yang kedua sudah
disisipi suatu sekuens tertentu yang
nanti akan mentarget DNA kita bedanya
disitu Lalu setelah ketiga komponen
penting ini masuk ke dalam satu
konstruksi vektor a akan siap untuk
memulai proses transformasi dimana
proses ini bisa dilakukan dengan
beberapa cara seperti pada proses
transformasi yang sudah dijelaskan pada
pertemuan-pertemuan sebelumnya yakni
bisa menggunakan agrobacterium atau
kroto brush atau partikel bombardment
Nah setelah ditransformasi
kemudian masuk kedalam sistem sel
kemudian dilakukan regenarasi untuk
proses regenarasi dan proses selanjutnya
bisa dilihat pada slide berikutnya
Hai Tahap selanjutnya adalah yang
keempat yakni regeneration skrining dan
juga validasi dari tanaman transgenik
yang diedit menggunakan sistem crispr
cas9 jadi teman-teman bisa melihat
kembali pada gambar nomor 5A merupakan
tahap skrining atau penapisan dan juga
seleksi dari hutan tanaman padi
Berdasarkan perubahan fenotipik
screening ini merupakan skrining awal
yang nantinya hasilnya akan digunakan
sebagai proses deteksi selanjutnya jadi
setelah kita skrining dan kita dapatkan
perubahan fenotip yang sesuai dengan
yang kita harapkan selanjutnya kita
lakukan deteksi galur-galur tanaman yang
mengalami mutasi karena agen crispr cas9
ini dilakukan dengan mengecek panjang
fragmen yang terbentuk pada Jal
elektroforesis terhadap dan target kita
galur-galur yang mengalami mutasi akan
terbentuk fragmen-fragmen dengan panjang
tertentu sesuai dengan Sisi pemotongan
sehingga pada gambar tersebut tampak ada
tiga sumuran pada gambar sebelah kiri
merupakan kontrol negatif atau website
gimana pada kontrol negatif ini a
fragment gen yang tidak disisipkan
sistem crispr cas9 dan tidak terjadi
pemotongan sehingga ukurannya masih
besar Kemudian pada gambar sampingnya
yang ada di tengah merupakan kontrol
positif yang merupakan profil fragmen
gen yang memiliki keberhasilan dalam
integrasi sistem Kris
39 kemudian disampingnya lagi adalah
Mutan yang berhasil mengintegrasikan
sistem crispr cas9 dalam genomnya
sehingga disini tampak profil kita
elektroforesis dengan fragmen yang
ukurannya paling besar yang paling atas
ini dimana fragmen ini adalah fragmen
yang masih utuh yang belum terdeteksi
atau belum dipotong kemudian dibawahnya
ada dua fragmen yang menunjukkan
keberhasilan integrasi sistem crispr
cas9 karena profilnya sama seperti
profil pada kontrol positif sehingga
bisa diletakkan dua pita Yang Dibawah
ini merupakan hasil pemotongan
hai hai
Hai selanjutnya pada gambar yang kelima
c masih dilakukan tahap skrining juga
akan tetapi skrining yang dilakukan
bertujuan untuk Menentukan persentase
sel yang berhasil diedit kepada tahap
ini skrining dilakukan menggunakan uji
survei AC atau disebut mismatch cliphit
detection ojek Dalam metode ini tergede
na dalam sel diamplifikasi melalui
reaksi PCR lalu didenaturasi kemudian
kembali di nailing lagi untuk membentuk
hibrid antara untai yang tidak berhasil
diedit dengan untai yang berhasil diedit
dalam prosesnya hibrid yang mismatch
atau hibrid edit dan yang tidak berhasil
diedit akan dipotong dengan enzim
endonuklease kemudian hasilnya akan
divisualisasikan
Kikan pada jeruk elektroforesis seperti
tampak pada gambar 5C di serat
sebelumnya dimana Tujuannya adalah untuk
memperkirakan berapa persen sel yang
berhasil diedit jadi dalam visualisasi
jok tersebut tampak profil berupa
kontrol yang ada di sebelah kiri
merupakan website di mana website ini
pabrik ada di bagian yang atas yang
mengindikasikan bahwa fragmen gen ini
berukuran besar yang belum diedit
melalui mekanisme pemotongan atau
cutting kemudian di PT yang sebelah
kanannya merupakan pita Mutan yang
terdiri dari fragmen-fragmen produk yang
belum diedit yang berada dipaling atas
sejajar dengan produk kontrol dan juga
ada produk yang berhasil diedit melalui
pemotongan sehingga terjadi mutasi
Hai nampak ada dua produk fragmen DNA
yang terbentuk dari hasil pemotongan ini
jadi produk fragmen ini menunjukkan
adanya fragmen yang berhasil diedit
kemudian lanjut pada gambar 5D merupakan
hasil verifikasi dan validasi dari
mutasi yang terjadi yang dilakukan
dengan menggunakan analisis sekuens
gimana analisis sekuens bisa menggunakan
next-generation sekuensing yang mampu
menganalisis seluruh khaul Jenong atau
bisa juga parsial menggunakan metode
sanger Kemudian pada gambar yang keenam
merupakan analisis lebih lanjut untuk
mendapatkan tanaman yang bebas dari
t-dna dari agrobacterium dan juga
Analisis yang digunakan untuk
Hai ikan perubahan fenotip yang terjadi
akibat Narko gen jadi setelah dilakukan
skrining verifikasi dan juga validasi
tetap harus dilakukan analisis lebih
lanjut terkait bebas atau tidaknya sel
yang berhasil diinstruksikan tersebut
terhadap DNA dan juga bagaimana Pak
kestabilan dari fenotip yang terbentuk
تصفح المزيد من مقاطع الفيديو ذات الصلة
5.0 / 5 (0 votes)