The Plasmid Cloning Cycle

Summary

Este video introduce el ciclo de clonación, un proceso iterativo esencial en la creación de clones moleculares. Explica los pasos clave: manipulación de ADN, transformación en bacterias, selección y cribado de clones, extracción de ADN y análisis de clones. Se destacan técnicas como las enzimas de restricción y ligasa, y métodos de selección como la resistencia a antibióticos y la técnica de selección azul-blanca. El vídeo también aborda la verificación de clones mediante secuenciación y digestión con enzimas de restricción, esencial para asegurar la precisión en experimentos moleculares.

Takeaways

• 🔬 El ciclo de clonación es una serie de pasos iterativos utilizados en la creación de un clon molecular.
• 🧬 Los pasos del ciclo de clonación incluyen: manipulación de ADN, transformación en una bacteria huepedor, selección y cribado de moléculas recombinantes candidatas, extracción de dichas moléculas y análisis de las mismas.
• 🔍 La manipulación de ADN se realiza para generar una molécula recombinante nueva, utilizando vectores como plásmidos y enzimas restrictas para cortar el ADN en secuencias específicas.
• 🌐 La transformación implica la introducción del ADN en bacterias, permitiendo que estas realicen copias del mismo.
• 🔬 La selección y cribado se utilizan para identificar las bacterias que contienen el plásmido con el fragmento de interés, a menudo con la ayuda de marcadores selectables y técnicas de cribado como la selección azul-blanca.
• 🌟 La extracción de ADN de las bacterias candidatas permite obtener muestras suficientes para su análisis.
• 🔍 La verificación de clones se realiza mediante secuenciación, digestión con enzimas restrictas o reacciones de PCR para confirmar la presencia correcta del fragmento de interés.
• 🔁 En experimentos de clonación más complejos, puede ser necesario repetir el ciclo de clonación varias veces para lograr el producto molecular deseado.
• 📈 La eficiencia de la clonación se mide por la proporción de clones con el fragmento de interés correcto, siendo el objetivo un 100% de eficiencia.
• 🔧 Si el clon resultante no es el correcto o se desea modificarlo, se vuelve a la manipulación de ADN para realizar ajustes y repetir el ciclo.

Q & A

¿Qué es el ciclo de clonación y por qué es importante en la biología molecular?

El ciclo de clonación es una serie de pasos que se realizan iterativamente durante la creación de un clon molecular. Es importante porque permite entender el papel de cada paso en el desarrollo de productos moleculares complejos.

¿Cuáles son los pasos del ciclo de clonación según el guion del video?

Los pasos son: 1) Manipulación de ADN, 2) Transformación de ADN en un hospedero bacteriano, 3) Selección y cribado de moléculas recombinantes candidatas, 4) Extracción de moléculas recombinantes candidatas de bacterias, 5) Análisis de moléculas recombinantes candidatas.

¿Qué es la manipulación de ADN y cómo se realiza en el ciclo de clonación?

La manipulación de ADN es el primer paso para generar una molécula recombinante nueva. Se utiliza a menudo a restricciones enzimas, conocidas como tijeras moleculares, que cortan el ADN en secuencias específicas para luego unir los fragmentos con la enzima DNA ligasa.

¿Qué es la transformación y cómo se relaciona con la introducción del ADN en bacterias?

La transformación es el proceso por el cual se introduce el ADN en las células bacterianas para que estas hagan copias de él. Se utilizan técnicas como las células competentes químicas o la electroporación para inducir a las bacterias a tomar el ADN del entorno.

¿Cómo se realiza la selección y el cribado de bacterias tras la transformación?

Después de la transformación, se utilizan placas de agar con antibióticos para seleccionar bacterias que hayan tomado plásmidos funcionales. Se puede aplicar también técnicas de cribado, como el uso de la fragmento lacZ alpha para la selección de color azul-blanco.

¿Qué es la extracción de moléculas recombinantes candidatas de bacterias y por qué es necesaria?

Es el proceso de aislamiento de ADN de bacterias candidatas para su análisis. Es necesario para verificar si la manipulación de ADN se realizó correctamente y para obtener suficiente material para el análisis.

¿Cómo se verifica la corrección de un clon en el ciclo de clonación?

El clon se verifica mediante técnicas como secuenciación, digestión con restricciones o reacciones PCR diagnosticas para asegurarse de que el fragmento de interés se haya introducido correctamente.

¿Qué sucede si el clon no es el correcto o se desea modificarlo?

Si el clon no es correcto o se desea modificarlo, se vuelve a la manipulación de ADN y se repiten los pasos del ciclo de clonación hasta obtener el producto deseado.

¿Cuáles son las posibles opciones para analizar los productos de clonación y verificar la precisión del clon?

Las opciones incluyen la secuenciación del ADN, la realización de digestos con restricciones para verificar el tamaño del inserto y reacciones PCR diagnosticas.

¿Por qué es importante asegurarse de que el clon sea preciso antes de proceder con el experimento?

Es crucial para evitar errores en los resultados y para garantizar que el clon tenga la inserción deseada, permitiendo así avanzar con confianza en las fases siguientes del experimento.

Outlines

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🔬 Ciclo de Clonación Molecular

Este video presenta el concepto del ciclo de clonación, un conjunto de pasos iterativos utilizados en la creación de un clon molecular. Se explican los roles de cada paso, desde la manipulación de ADN hasta el análisis de los clonados candidatos. Se destaca la importancia de entender cómo encajan estos pasos para desarrollar productos moleculares complejos. Se describen los pasos: manipulación de ADN, transformación en un hospedador bacteriano, selección y cribado de moléculas recombinantes candidatas, extracción de dichas moléculas de las bacterias y análisis de las moléculas recombinantes. Además, se menciona que en experimentos de clonación simples, es posible que se necesite pasar por estos pasos una vez, mientras que en experimentos más complejos, se puede requerir repetir el ciclo varias veces.

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🧬 Selección y Detección de Clonados

El segundo párrafo se centra en el proceso de selección y cribado de los clonados tras la transformación bacteriana. Se discute cómo se identifican los clones con el fragmento de interés correcto y se menciona la eficiencia de la reacción de clonación. Se explica que la selección se basa en la resistencia a los antibióticos de los plásmidos circularizados, permitiendo que solo las bacterias que contienen dichos plásmidos puedan crecer. Se detalla el proceso de cribado, donde se utiliza la técnica de selección de azul-blanco para identificar clones con insertos correctos. Se describen los componentes del plásmido, como el sitio de clonación múltiple y el fragmento lacZ alpha, y cómo estos afectan la apariencia de las colonias bacterianas en el plato. Finalmente, se resume el proceso de clonación y se menciona la extracción de ADN de las bacterias candidatas para su análisis.

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🔍 Verificación y Optimización de Clonados

El tercer párrafo aborda la verificación de los clones y las opciones disponibles para asegurarse de que el clon es preciso antes de proceder con el experimento. Se discuten los métodos de verificación, como la secuenciación, la digestión con restricciones y la reacción PCR diagnostica. Se describen los posibles resultados de la verificación y las acciones correspondientes, como volver a manipular el ADN o proceder con el experimento si el clon es correcto. Se enfatiza la importancia de la flexibilidad en la manipulación del ADN y se menciona que en futuras videos se explorarán técnicas adicionales para planificar proyectos de clonación. Se invita al espectador a visitar snapgene.com para obtener más información sobre la clonación molecular y se mencionan temas adicionales que se abordarán en la serie de videos.

Keywords

💡Ciclo de clonación

El ciclo de clonación es un conjunto de pasos iterativos que se siguen durante la creación de un clon molecular. Es fundamental para entender cómo se desarrolla un producto molecular complejo, ya que cada paso tiene un rol específico en el proceso. En el video, se describe cómo estos pasos se encadenan para manipular el ADN y obtener el clon molecular deseado.

💡Manipulación de ADN

La manipulación de ADN es el primer paso del ciclo de clonación y tiene como objetivo generar un nuevo molecule recombinante. Esto se logra a través de la utilización de enzimas de restricción, que actúan como tijeras moleculares, y de la ligasa, que une las piezas de ADN. En el guion, se menciona que este proceso puede involucrar la creación de un vector con el fragmento de interés.

💡Transformación

La transformación es el segundo paso del ciclo de clonación y implica la introducción del ADN manipulado en una bacteria huera. Se menciona en el video que las bacterias tienen la capacidad natural de absorber material genético, y los científicos han optimizado este proceso utilizando técnicas como las células competentes químicas o la electroporación.

💡Selección y cribado

El tercer paso, selección y cribado, se realiza después de la transformación y consiste en identificar y aislar los clones que contienen el ADN de interés. Se utiliza un marcador selectable, como una resistencia a los antibióticos, para identificar a las bacterias que han tomado el plásmido. El cribado se menciona como un método adicional para garantizar que se estén observando plásmidos recombinantes.

💡Extracción de ADN

La extracción de ADN de las bacterias es el cuarto paso y es necesario para obtener los clones candidatos para su análisis. Se menciona en el video que se utilizan técnicas estándar de mini-preparación de ADN para obtener las muestras necesarias.

💡Análisis de clones candidatos

El análisis de clones candidatos es el último paso del ciclo de clonación y se trata de verificar si el clon molecular tiene el fragmento de interés correcto. El video destaca la importancia de estar 100% seguro de que el clon es correcto antes de proceder, y menciona métodos como la secuenciación, la digestión con enzimas de restricción y la reacción PCR diagnostica.

💡Vector de clonación

Un vector de clonación es una molécula de ADN que se utiliza para transportar un fragmento de interés dentro de una bacteria. En el video, se describe cómo el vector, representado por un plásmido, se manipula para incluir el fragmento de interés y cómo se utiliza en el proceso de clonación.

💡Restricción

La restricción es el proceso de cortar el ADN utilizando enzimas de restricción, que reconocen secuencias específicas en el ADN. Esto se menciona en el video como un método clásico para manipular el ADN en el primer paso del ciclo de clonación.

💡Ligasa

La ligasa es un enzima que se utiliza para unir las piezas de ADN cortadas por las enzimas de restricción. En el video, se explica cómo la ligasa permite la reconexión del vector y el fragmento de interés, formando un recombinante.

💡Selección por color (Blue-White Selection)

La selección por color es una técnica de cribado que se basa en la presencia o ausencia de un marcador visible, como la producción de color en una placa de cultivo. En el video, se describe cómo las colonias con vector sin inserto se vuelven azules y las que contienen el inserto correcto permanecen blancas debido a la interrupción de la producción de beta-galactosidasa.

💡Efectividad de clonación

La eficacia de clonación se refiere a la proporción de clones que contienen el fragmento de interés correcto. El video menciona que una alta eficacia de clonación es ideal, lo que significa que la mayoría o todos los clones tienen el inserto correcto.

Highlights

Introducción al concepto del ciclo de clonación, un proceso iterativo utilizado en la creación de clones moleculares.

Se describen los pasos del ciclo de clonación: manipulación de ADN, transformación, selección y cribado, extracción y análisis de moléculas recombinantes candidatas.

En experimentos de clonación simples, es necesario insertar un fragmento de ADN en un plásmido siguiendo los pasos uno a cinco.

Experimentos de clonación más complejos pueden requerir repetir los pasos del ciclo dos o más veces.

La manipulación de ADN se realiza para generar un nuevo molecule recombinante, utilizando plásmidos como vectores para propagar el fragmento de interés.

Las enzimas de restricción, conocidas como tijeras moleculares, se utilizan para cortar el ADN en secuencias específicas.

La ligación de fragmentos de ADN con extremos compatibles se realiza mediante la enzima DNA ligasa.

Después de la ligación, pueden ocurrir tres resultados: el vector se auto-liga, un fragmento azul se liga al vector o el fragmento rojo se liga al vector.

El objetivo es identificar clones correctos donde el fragmento rojo esté ligado al vector vacío.

La transformación implica introducir la mezcla de ADN en bacterias y permitir que estas realicen copias del mismo.

Las bacterias tienen la capacidad natural de absorber material genético de su entorno, proceso que se puede optimizar.

La selección y cribado se realizan para identificar bacterias que han adquirido plásmidos funcionales, utilizando genes de resistencia a antibióticos.

La selección se basa en la sobrevivencia de bacterias que han tomado plásmidos en presencia de antibióticos.

El cribado se utiliza para distinguir entre clones con el inserto correcto y aquellos que no lo tienen.

La técnica de selección y cribado común es la selección azul-blanca, que utiliza la fragmentación del gen lacZ alpha para identificar clones recombinantes.

La extracción de ADN de bacterias identificadas como candidatas se realiza mediante un mini preparado de ADN.

La verificación de clones se realiza mediante secuenciación, digestión con enzimas de restricción o reacciones de PCR diagnosticas.

El resultado final puede ser que el clone no es correcto, es correcto pero requiere modificación, o es correcto y se procede con el producto final.

Los pasos de transformación, selección y extracción de ADN son rutinarios, mientras que la verificación de clones es esencial y limita las opciones.

Se destaca la flexibilidad en la manipulación de ADN y se mencionan futuras presentaciones sobre técnicas de clonación.

Transcripts

In this video, we would like to introduce you,

to the concept of the cloning cycle.

The cloning cycle is a series of steps,

frequently performed iteratively,

during the creation of a molecular clone.

By understanding the role of each of these steps,

in the cloning cycle, you should learn,

how these phases of the cloning experiment fit together,

when you are developing a complex molecular product.

The steps of the cloning cycle are outlined here.

First, manipulation of DNA.

Second, transformation of DNA into a bacterial host.

Third, selection and screening,

for candidate recombinant molecules.

Fourth, extraction of candidate recombinant molecules,

from bacteria.

Fifth, analysis of candidate recombinant molecules.

In a simple cloning experiment,

you may need to accurately insert a DNA fragment,

into your plasmid, passing through steps,

one through five, one time.

More complex cloning experiments,

will require you to cycle through the steps,

two or more times.

Let's explore what happens at each of the five steps.

Step one, manipulation of DNA.

The purpose of this step,

is to generate a novel recombinant molecule.

We have discussed the use of a plasma as a vector,

to propagate a DNA fragment of interest.

In yellow, we can see our intact plasmid or cloning vector.

Next to that, we can see a representative genomic DNA,

depicted in red and blue.

The red fragment is the piece that we would like to clone,

which we will refer to as the fragment of interest.

The blue represents extraneous material.

The classic approach to this step,

is the use of restriction enzymes,

which we will elaborate on in a dedicated video series.

Even later we will discuss the great variety of ways,

in which DNA can be manipulated in the plasma cloning cycle,

without touching a restriction enzyme.

Restriction enzymes are often described,

as molecular scissors,

which are capable of cutting DNA at specific sequences.

As long as the plasmid and the insert DNA,

have been cut with one or more restriction enzymes,

that create compatible ends,

those fragments can be litigated back together,

using an enzyme called DNA ligase.

Let's take a closer look.

After treatment with restriction enzymes,

our plasma has become linear.

Separately,

we will treat the source of our fragment of interest,

with the same restriction enzymes, creating DNA fragments,

including our fragment of interest, shown in red.

After ligation, there are three possible outcomes.

The vector can re-ligate back to itself.

A blue fragment can ligate into the vector.

The red fragment can ligate into the vector.

When we are done with our colonial experiment,

we want to identify a correct clone.

One in which the red fragment,

has been ligated into the empty vector.

In an optimal cloning experiment,

90 to 100% of your clones,

have the desired fragment of interest.

Step two, transformation.

Before we can analyze candidate clones,

we will introduce the DNA mixture into bacterial cells,

and allow the bacteria to make copies for us.

Bacteria have a natural tendency,

to absorb genetic material in their environments.

Scientists have learned how to optimize this process.

The most common technique used in labs,

is chemically competent cells.

Electroporation is a great alternative,

if your lab has an electroporator.

With either technique chemical transformation,

or electroporation, a very small proportion of cells,

are induced to take DNA from the surrounding environment.

This is where the selectable marker on your DNA vector,

comes into play.

Step three, selection in screening.

After you have transformed your ligation mixture,

into bacteria, you now potentially,

have a complex population of bacteria.

Some bacteria might not have survived transformation.

Some are still viable, but did not take up DNA.

Since we included an antibiotic resistance gene,

on the plasma, we can select for those bacteria,

which acquired a functional plasmid.

Then if necessary,

we can also apply a screening technique,

to guarantee that we will be looking at recombinant plasma,

in our next step.

Let's take a moment to talk about selection,

and screening separately.

Step three-A, selection.

Once DNA has been introduced into the competent bacteria,

the bacteria are generally allowed to recover,

and are then plated on auger plates for growth.

Because our plasma has an antibiotic resistance gene on it,

and we are including antibiotics in the media,

only cells that have received circularized plasma,

during the transformation will be able to grow.

This process is called selection.

As we mentioned above, there are three types of plasmids,

that could result from our cloning,

plasmid with no insert, plasmid with the wrong insert,

plasmid with the correct insert.

All of these plasmids will promote growth of bacteria,

in the presence of antibiotics.

Our next job is to figure out,

which of the clones are the ones with the correct insert.

Depending on the cloning technique used,

there may be many,

or just a few desired clones on your plate.

This is referred to as cloning efficiency.

If you're cloning reaction is highly efficient,

most of your clones will have the correct insert.

Ideally, your cloning reaction is 100% efficient,

with all clones having the correct insert.

If for some reason you observe or anticipate,

a high proportion of clones which have no insert,

you have the option of eliminating erroneous clones,

by screening.

Step three-B, screening.

Screening is a general term distinct from selection,

where you need to examine your sample,

for a specific phenotype.

When necessary,

screening and selection are done at the same time,

because the majority of plasmids,

contain the lacZ alpha fragment,

that allows for the common selection technique,

known as blue-white selection.

In order to apply selection to your transformation,

you simply need to change the growth conditions.

Let's take a closer look at our plasmid,

and the elements involved.

Most plasmids contain a multi-cloning site,

and it is generally located,

within the lacZ alpha gene fragment.

When a plasmid like this is intact,

lacZ alpha is also intact.

lacZ alpha encodes a small protein fragment,

that allows certain E-coli,

to form a complete beta-galactosidase protein.

Beta-galactosidase is an enzyme,

whose normal substrate is lactose.

Several chemicals have been identified,

that will change color upon exposure to beta-galactosidase,

including the commonly used X-gal, which turns blue.

When lacZ alpha has been disrupted,

by cloning into the multi-cloning site,

it can no longer complete the production,

of functional beta-galactosidase.

As a result,

chemical substrates will not be activated to change color.

In short, a re-circularized empty vector,

will contain an intact lacZ alpha fragment,

bacteria carrying this plasmid can turn blue.

In contrast,

if an insert has disrupted the lacZ alpha fragment,

it is no longer functional,

these colonies therefore remain white.

The plate on this slide shows examples of colonies,

carrying empty vector, which are the blue colonies.

In colonies carrying a vector,

which has acquired a fragment within the multi cloning site,

these are the white colonies.

Again, depending on your cloning strategy,

you might not perform the screen,

but many plasmids carry the lacZ alpha fragment,

to provide this option.

At this point let's start putting these steps together,

and summarize in this slide,

you can see our starting material,

which we can refer to generically,

as a vector and a fragment of interest.

In this example,

manipulation of the DNA is being done,

with restriction enzymes and ligase.

After manipulating the DNA, you transform bacteria,

and allow the bacteria to reproduce.

Bacteria will be exposed to an antibiotic,

such as ampicillin,

so that only bacteria carrying a circular plasmid can grow.

At this point,

we have the option of screening bacterial colonies as well,

to see if they carry an insert.

Step four, extraction from bacteria.

Once candidate clones have been identified,

we need to inoculate small bacterial cultures,

so that we can extract sufficient DNA for analysis.

We will extract the DNA using a routine procedure,

called the DNA mini prep.

There are many DNA mini prep kits on the market.

Once purified, we will analyze the DNA,

to see if our fragment of interest has been introduced.

Step five, clone verification.

Now that we have isolated DNA back out of the bacteria,

we need to verify which clone or clones,

are the ones we are after.

Let's take a quick look at these options.

By far and away,

the most method for this purpose is sequencing.

You can also do a quick restriction digest to get an idea,

if you have the correct size insert.

Another option would be a diagnostic PCR reaction.

Pros and cons of these choices will be discussed later.

However, it is important to be 100% sure,

your clone is accurate,

before proceeding to the next step in your experiment.

Now that we have looked at these steps separately,

let's put all of the steps of the cloning cycle together,

in a flow chart.

First, you manipulate your DNA sources.

In this example,

we referred to classic restriction enzyme cloning,

which uses restriction enzymes and ligase,

to create novel recombinant molecules.

Next, you transform your mixture of DNA into E-coli.

Third, following transformation,

you plate your transformed bacteria on media,

that will select for bacteria,

that have taken up plasmid.

At this point,

you may also choose to screen for candidate clones.

In the next step, you extract the candidate plasma DNA,

using a routine mini prep.

Finally, you analyze your DNA,

to determine if your DNA manipulation was successful.

There are three possible outcomes.

The first outcome is that the clone is not correct.

If this is the case,

you will most likely return to the top of the flow chart,

to manipulation of DNA,

possibly including some troubleshooting.

The next possible outcome is that the clone is correct,

but you desire to modify it.

In this case, you return to the top of the flow chart,

and do another manipulation to your DNA.

The final possible outcome is that the clone is correct,

and it is your desired finished product.

In this case,

you will proceed with other aspects of your experiment.

Steps two through four,

transformation selection and extraction of DNA,

are extremely routine.

Analysis of your cloning products,

or clone verification is essential,

but there are really only a few options to choose from.

You will have the most flexibility,

when you are manipulating your DNA.

Our upcoming videos,

we'll get into the various techniques you can choose from,

as you plan your cloning project.

To learn more about molecular cloning, visit snapgene.com.

You can also view the remaining videos in this series,

that cover the following topics.

(upbeat music)

(outro)