Biochemical and Technical Concepts in the Seahorse XFp Mito Stress Test and ATP Rate Assay

Summary

Dieses Skript bietet einen Einblick in die Anwendung des Seahorse XFp Zell-Stress-Tests zur Messung der Mitochondrienleistung und ATP-Produktion. Es erklärt die Konzepte der Mitochondrienatmung, des Protonenflusses und die Durchführung von Tests mit dem Seahorse-Gerät. Es werden detailliert der Mito Stress Test und die ATP Rate Assay vorgestellt, die dabei helfen, verschiedene Parameter der Zellatmung zu bestimmen und die ATP-Produktion aus Glykolyse und Mitochondrien zu quantifizieren. Zudem wird auf die Bedeutung der Zellzählung und die Optimierung der Zellzahlen für genaue Messungen hingewiesen.

Takeaways

• 🧪 Die Vorlesung behandelt biochemische und technische Konzepte im Zusammenhang mit dem Seahorse XFp Cell Mito Stress Test und der Echtzeit-ATP-Rate-Assay.
• 🔍 Man kann Mitochondrienleistung und ATP-Produktion messen, indem man spezifische Proteinfunktionen verändert und den Sauerstoffverbrauch und die extracellulare Versauerung misst.
• 🛠 Es ist möglich, mit einem Sauerstoffsensor und einem pH-Meter einen eigenen Messapparat zu bauen, aber es ist effizienter, den Seahorse XFp oder ähnliche Geräte mit dazugehörigen Reagenzkits zu verwenden.
• 🏫 Es gibt verschiedene Seahorse-Geräte auf dem Campus, einschließlich des XF24 für Gewebeproben, sodass man nicht auf ein bestimmtes Instrument beschränkt ist.
• 🔬 Die Mito Stress Test ermöglicht die Messung verschiedener Parameter wie basaler Atmung, ATP-Produktion, maximale Atmung, Reservekapazität, nicht-mitochondrialer Sauerstoffverbrauch und Protonleck.
• 📈 Die ATP-Rate-Assay erlaubt die Quantifizierung des ATP, das von den Mitochondrien produziert wird, und ermöglicht es, den ATP-Gehalt pro Zelle zu bestimmen.
• 🌡 Der Seahorse XFp misst pH und Sauerstoffverbrauch, was es einem teuren pH-Messgerät und Sauerstoffsensor gleichkommt, und erlaubt es, Zellen mit verschiedenen Substanzen zu behandeln.
• 🔄 Der Citratzyklus und die Elektronentransportkette sind für den Sauerstoffverbrauch und die ATP-Produktion in den Mitochondrien verantwortlich.
• 📉 Durch Modifikation des Sauerstoffverbrauchs kann man ableiten, wie gut verschiedene Aspekte des Citratzyklus und der Elektronentransportkette funktionieren.
• 🧫 Die Zellzählung ist entscheidend für die Genauigkeit der Normalisierung der Daten; die Verwendung von Hoechst zur Anfärbung und Zählung der Zellen hilft dabei, eine genaue Zellzahl zu erhalten.
• 🔬 Es gibt verschiedene Methoden zur Normalisierung, darunter die Bestimmung der Gesamt-DNA- oder -Proteininhalte, aber die Zellzählung ist zunehmend beliebt und bietet präzise Ergebnisse.

Q & A

Was ist das Hauptthema des Vortrags?

Das Hauptthema des Vortrags ist die Beschreibung von biochemischen und technischen Konzepten in der Sehmaschine XFp Zell-Stresstest und der Echtzeit-ATP-Rate-Bestimmung.

Was sind die Hauptfunktionen von Mitochondrien?

Mitochondrien haben viele Funktionen in der Zelle, von denen die meisten jedoch direkt oder indirekt mit der ATP-Produktion verbunden sind. Sie wandeln Pyruvat und Fettsäuren in Sauerstoff, ATP, Wasser und Kohlenstoffdioxid um.

Wie kann man die Leistung von Mitochondrien messen?

Man kann die Leistung von Mitochondrien messen, indem man die Sauerstoffaufnahme und die extracellulare Säuerung misst, um verschiedene Aspekte der Mitochondrienleistung und deren ATP-Produktion zu schätzen.

Was ist das Seahorse XFp und wie wird es verwendet?

Das Seahorse XFp ist ein Instrument, das zur Messung der Sauerstoffaufnahme und der extracellularen Säuerung verwendet wird. Es ermöglicht es, die Leistung von Mitochondrien und deren ATP-Produktion zu messen.

Was ist der Zweck des Mito Stress Tests?

Der Mito Stress Test ermöglicht die Messung verschiedener Parameter wie basale Atmung, ATP-Produktion, maximale Atmung, Reservekapazität, nicht-mitochondriale Sauerstoffaufnahme und Proton-Leak.

Was ist die ATP-Rate-Bestimmung und welche Informationen liefert sie?

Die ATP-Rate-Bestimmung ist ein Verfahren, das es ermöglicht, die Menge an ATP, die von den Mitochondrien und Glykolyse produziert wird, zu quantifizieren. Sie liefert Informationen über die ATP-Produktion pro Zelle und pro Minute.

Wie wird die Anzahl der Zellen in den Meeressäbler-Platten gemessen?

Die Anzahl der Zellen wird durch das Anfärben der Meeressäbler-Platten mit Hoechst und die anschließende Zählung der Zellkerne unter einem fluoreszierenden Mikroskop gemessen.

Welche Rolle spielen Oligomycin und FCCP in den genannten Messungen?

Oligomycin hemmt die ATP-Synthese, was die Zellen dazu zwingt, durch Proton-Leak Sauerstoff zu konsumieren. FCCP, ein Protonofor, ermöglicht es Protonen, die Membran ohne die ATP-Synthese zu durchqueren, was die maximale Atmung und Reservekapazität zeigt.

Was sind die Vorteile des Einsatzes von Seahorse XFp im Vergleich zu selbstgebauten Messeinrichtungen?

Das Seahorse XFp ist einfacher und effizienter zu verwenden als selbstgebaute Messeinrichtungen, da es spezielle Sensoren für Sauerstoff und pH-Wert enthält und die Anwendung verschiedener Substanzen ermöglicht.

Welche anderen Assays kann man mit dem Seahorse XFp durchführen?

Mit dem Seahorse XFp können auch andere Assays durchgeführt werden, wie der Glycolysis-Rate-Assay, der Glykolysis-Stress-Test und einige weitere, die jedoch weniger häufig in der Veröffentlichung erscheinen.

Wie ist die Bedeutung von Glykolyse für die ATP-Produktion in Zellen?

Glykolyse ist ein weiterer Prozess in Zellen, der ATP produziert. Durch die Messung der extracellularen Säuerung kann man die Aktivität von Glykolyse und somit die ATP-Produktion durch diesen Prozess schätzen.